Summary

Выделение головного и спинного мозга одноядерных клеток Использование Перколла Градиенты

Published: February 02, 2011
doi:

Summary

Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для проточной цитометрии анализа.

Abstract

Выделение иммунные клетки, которые проникают в центральную нервную систему (ЦНС), во время инфекции, травмы, аутоиммунные заболевания или нейродегенерации, часто требуется, чтобы определить их фенотип и эффекторные функции. Гистохимические подходы играют важную роль для определения расположения проникновения клеток и исследованы соответствующие патологии ЦНС. Тем не менее, на месте гистохимии и иммунофлуоресцентного методы окраски ограничено количество антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы характеризовать иммунную подтипов ячейку в определенной ткани. Таким образом, гистологические подходов в сочетании с иммунной фенотипирование методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полного описания состава местной инфильтрационной ЦНС. Этот протокол основан на разделении ЦНС сотовой надстройки над discontinous Перколла градиентов. Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для идентификации различных иммунных клеточных популяций в одном образце с помощью проточной цитометрии.

Protocol

Подготовка реагентов Подготовка акции изотонический Перколла (SIP), 4 мл на мозг, путем смешивания 9 частей Перколла с одной частью 10X HBSS без Ca + + и Mg + +. Подготовка SIP на 70% в 1X HBSS без Ca + + и Mg + +, 2 мл на мозг обойтись в 15 мл полипропилен конической трубе. <p class="jove_con…

Discussion

Анализ поверхности клеток маркеры в ЦНС лейкоцитов из нормальных и воспаленных тканях мышей был использован в течение нескольких десятилетий 1-3. Изоляция протоколы основаны на разделении микроглии и лейкоцитов по плотности 4 центрифугирования. Здесь мы опишем быстрый и эф…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза (TA 3021-A1 / T для AEC) и Техасского университета в Сан-Антонио.

Materials

Tissue homogenization and Gradients

  • Percoll (Amersham)
  • 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
  • RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
  • 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)

Flow cytometry

  • Cell Staining Buffer (Biolegend)
  • Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
  • Hemacytometer (Fisher)
  • Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
  • 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
  • Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
  • Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)

References

  1. Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
  2. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  3. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  4. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  5. Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
  6. Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
  7. Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
  8. Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).

View Video