Summary
Ce protocole vidéo illustre la méthode de dosage Neurosphère de générer et de développer des cellules souches neurales de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles.
Abstract
L'isolement et l'expansion des cellules souches neurales putatifs (CNS) à partir du cerveau adulte murin a été décrite par Reynolds et Weiss en 1992 emploie un système de culture chimiquement défini sans sérum connu comme le test Neurosphère (NSA). Dans cet essai, la majorité des types de cellules différenciées meurent dans les quelques jours de culture, mais une petite population de cellules précurseurs de la croissance des facteurs réactifs subissent une prolifération active, en présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et / facteur de croissance basique fibroblastique (bFGF). Ces cellules forment des colonies de cellules indifférenciées appelées neurosphères, qui à leur tour peuvent être repiquées pour élargir le pool de cellules souches neurales. Par ailleurs, les cellules peuvent être induites à se différencier, générant des trois principaux types de cellules des neurones du SNC-dire, les astrocytes et des oligodendrocytes. Ce test fournit un outil précieux pour fournir une approche cohérente, source d'énergie renouvelable des précurseurs du SNC indifférencié, ce qui pourrait être utilisé pour des études in vitro et également à des fins thérapeutiques.
Cette vidéo illustre la méthode la NSA pour générer et développer NSCs de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles. La procédure comprend la récolte du cerveau de la souris adulte, la micro-dissection de la région périventriculaire, préparation des tissus et la culture dans la NSA. Le tissu est d'abord récolté chimiquement digérés par la trypsine-EDTA et ensuite dissociées mécaniquement dans le milieu de NSC pour parvenir à une suspension cellulaire unique et finalement plaqué dans la NSA. Après 7-10 jours de culture, les neurosphères résultant primaires sont prêts pour la sous-culture pour atteindre la quantité de cellules nécessaires pour de futures expériences.
Protocol
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Discussion
Le dosage de Neurosphère 2 a gagné une grande attention dans la communauté de la recherche non seulement pour l'isolement et l'étude de NSC à partir du SNC 4-5, mais aussi pour l'isolement des autres types de cellules souches à partir de nombreux tissus putatifs, comme la poitrine de 6 et 7 et le cœur pour l'identification du cerveau, du sein et du côlon cellules souches tumorales 8-9 suggérant que ce système de culture peut être appliqué à un certain nombre de tumeurs somatiques et des populations de cellules précurseurs de tout le corps. Certains des avantages de cette méthode comprennent sa simplicité, la reproductibilité et la génération de nombre indéfini de cellules à partir d'un petit morceau de tissu ou même d'un petit nombre de cellules dans un milieu chimiquement défini sans sérum.
Il convient de souligner que le nombre de neurosphères dans la culture ne représente pas le nombre de cellules souches comme neurosphères peuvent être dérivées soit de bonne foi ou les cellules souches provenant de plus les cellules progénitrices restreintes 10. À cet égard un test a été développé pour recenser correctement les CNS dans la culture 11.
Différentes méthodes sont utilisées pour dissocier neurosphères en suspension cellule unique, y compris des méthodes mécaniques et enzymatiques. Bien que la méthode mécanique est la méthode originale de dissociation Neurosphère 2, il requiert beaucoup d'expérience et de son efficacité varie en fonction de l'opérateur. Cette méthode peut aussi causer la mort des cellules et des dommages importants si elle est appliquée par un individu inexpérimenté, ce qui peut diminuer la précision des dosages qui reposent sur la dissociation Neurosphère 3. Trypsine-EDTA dissociation enzymatique a aussi quelques avantages et inconvénients. Dissociation enzymatique des neurosphères est facile, efficace et reproductible si elle est effectuée pour la durée appropriée et sur les neurosphères la bonne taille. Bien qu'il n'y ait pas de côté par les études comparant les effets secondaires de ces deux méthodes de Neurosphère dissociation, notre expérience montre qu'une brève incubation (3-5 minutes) de l'neurosphères (jusqu'à 250 um) à la trypsine-EDTA en résulte une efficacité de dissociation sans déranger leurs capacités de viabilité, la prolifération et la différenciation. D'autre part, l'exposition de longues neurosphères (surtout pour les grandes neurosphères envahis) à la trypsine-EDTA peut causer de graves dommages aux récepteurs de surface cellulaire, la digestion et la mort cellulaires potentiellement cellule. La surexposition à la trypsine-EDTA pourrait aussi interférer avec la formation de la sphère et les cellules provoquer d'attacher au substrat et se différencier.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
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- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
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- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
