Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere
Summary
Este protocolo video demonstra o método de ensaio neurosphere para gerar e expandir as células-tronco neurais adultas da região periventricular do mouse, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível.
Abstract
Isolamento e expansão do suposto células-tronco neurais (NSCs) do cérebro adulto murino foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss, em 1992, empregando um sistema de cultura quimicamente definido sem soro conhecido como o ensaio neurosphere (NSA). Neste ensaio, a maioria dos tipos de células diferenciadas morrer dentro de alguns dias de cultura, mas uma pequena população de células precursoras do fator de crescimento sensível sofrem proliferação ativa na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e / fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Essas células formam colônias de células indiferenciadas chamada neurospheres, que por sua vez podem ser repicadas para expandir o pool de células-tronco neurais. Além disso, as células podem ser induzidas a se diferenciar, gerando os três principais tipos de células dos neurônios do SNC, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos. Este teste fornece uma ferramenta valiosa para fornecer uma fonte consistente e renováveis de precursores indiferenciados CNS, que poderiam ser usados para estudos in vitro e também para fins terapêuticos.
Este vídeo demonstra o método NSA para gerar e expandir NSCs da região do rato adulto periventricular, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita do cérebro do rato adulto, micro-dissecção da região periventricular, preparação de tecidos e cultura na NSA. O tecido colhido é o primeiro quimicamente digerida com tripsina-EDTA e, em seguida mecanicamente dissociado em meio NSC para alcançar uma suspensão única célula e, finalmente, banhado na NSA. Após 7-10 dias de cultura, o resultado primário neurospheres estão prontos para a subcultura para alcançar a quantidade de células necessárias para futuros experimentos.
Protocol
Discussion
O ensaio neurosphere 2 ganhou ampla atenção na comunidade de pesquisa não só para o isolamento e estudo de NSCs do CNS 05/04, mas também para o isolamento de outros tipos de células-tronco a partir de tecidos putativa numerosos, como os de mama 6 e 7 e coração para a identificação de câncer de mama, cérebro e células-tronco tumor de cólon 09/08 sugerindo que este sistema de cultura pode ser aplicado a um número de somáticas e populações precursor t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
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