Summary
Este protocolo video demonstra o método de ensaio neurosphere para gerar e expandir as células-tronco neurais adultas da região periventricular do mouse, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível.
Abstract
Isolamento e expansão do suposto células-tronco neurais (NSCs) do cérebro adulto murino foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss, em 1992, empregando um sistema de cultura quimicamente definido sem soro conhecido como o ensaio neurosphere (NSA). Neste ensaio, a maioria dos tipos de células diferenciadas morrer dentro de alguns dias de cultura, mas uma pequena população de células precursoras do fator de crescimento sensível sofrem proliferação ativa na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e / fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Essas células formam colônias de células indiferenciadas chamada neurospheres, que por sua vez podem ser repicadas para expandir o pool de células-tronco neurais. Além disso, as células podem ser induzidas a se diferenciar, gerando os três principais tipos de células dos neurônios do SNC, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos. Este teste fornece uma ferramenta valiosa para fornecer uma fonte consistente e renováveis de precursores indiferenciados CNS, que poderiam ser usados para estudos in vitro e também para fins terapêuticos.
Este vídeo demonstra o método NSA para gerar e expandir NSCs da região do rato adulto periventricular, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita do cérebro do rato adulto, micro-dissecção da região periventricular, preparação de tecidos e cultura na NSA. O tecido colhido é o primeiro quimicamente digerida com tripsina-EDTA e, em seguida mecanicamente dissociado em meio NSC para alcançar uma suspensão única célula e, finalmente, banhado na NSA. Após 7-10 dias de cultura, o resultado primário neurospheres estão prontos para a subcultura para alcançar a quantidade de células necessárias para futuros experimentos.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio neurosphere 2 ganhou ampla atenção na comunidade de pesquisa não só para o isolamento e estudo de NSCs do CNS 05/04, mas também para o isolamento de outros tipos de células-tronco a partir de tecidos putativa numerosos, como os de mama 6 e 7 e coração para a identificação de câncer de mama, cérebro e células-tronco tumor de cólon 09/08 sugerindo que este sistema de cultura pode ser aplicado a um número de somáticas e populações precursor tumor de células por todo o corpo. Algumas das vantagens deste método incluem a sua simplicidade, reprodutibilidade e geração de número indefinido de células de um pequeno pedaço de tecido ou mesmo um pequeno número de células em uma química definida meio isento de soro.
Deve-se ressaltar que o número de neurospheres na cultura não representa o número de células-tronco como neurospheres pode ser derivada a partir bona fide células-tronco ou células progenitoras de mais restrita 10. A este respeito um ensaio foi desenvolvido para enumerar corretamente NSCs na cultura 11.
Diferentes métodos são usados para dissociar neurospheres em suspensão única célula, incluindo métodos mecânicos e enzimáticos. Embora método mecânico é o original método de dissociação neurosphere 2, que exige muita experiência e sua eficiência varia de acordo com o operador. Este método também pode causar morte celular e danos significativos, se aplicada por um indivíduo inexperiente, que pode diminuir a precisão dos ensaios que dependem neurosphere dissociação 3. Tripsina-EDTA dissociação enzimática também tem algumas vantagens e desvantagens. Dissociação enzimática de neurospheres é fácil, eficiente e reprodutível se realizado para o período de tempo adequado e no neurospheres tamanho certo. Embora não existam lado a lado estudos comparando os efeitos desses dois métodos de neurosphere dissociação, nossa experiência mostra que uma breve incubação (3-5 minutos) do neurospheres (até 250 mm) com tripsina-EDTA resulta em uma dissociação eficiente sem perturbar a sua capacidade de proliferação, viabilidade e diferenciação. Por outro lado, a exposição prolongada da neurospheres (especialmente para os grandes neurospheres overgrown) para tripsina-EDTA pode causar sérios danos aos receptores de superfície celular, a digestão ea morte celular potencialmente celular. Superexposição a tripsina-EDTA pode também interferir com a formação de esfera e células causa para anexar ao substrato e se diferenciar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
