Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme
Summary
Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.
Abstract
Yetişkin fare beyin varsayılan sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) izolasyonu ve genişleme ilk neurosphere assay (NSA) olarak bilinen kimyasal olarak tanımlanmış serum serbest kültür sistemi istihdam Reynolds ve Weiss tarafından 1992 yılında tarif edilmiştir. Bu testte, farklılaşmış hücre tiplerinin çoğunluğu kültür birkaç gün içinde ölürler ama küçük bir nüfus büyüme faktörü duyarlı öncü hücreler aktif proliferasyonu epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF) varlığında tabi. Bu hücreler nöral kök hücre havuzu genişletmek için pasajlandı olabilir neurospheres adlı farklılaşmamış hücreler, koloniler oluşturur. Ayrıca, hücrelerin, merkezi sinir sistemi, yani nöronlar, astrositler ve oligodendrosit üç ana hücre tipleri üreten ayırt etmek için uyarılan olabilir. Bu testte, in vitro çalışmalar ve aynı zamanda tedavi amaçlı kullanılan olabilir farklılaşmamış MSS öncüleri, tutarlı bir, yenilenebilir kaynak sağlamak için paha biçilmez bir araç sağlar .
Bu video NSC'lerde yetişkin fare periventriküler bölge oluşturmak ve genişletmek için NSA yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar. Bu prosedür, NSA yetişkin fare, periventriküler bölgede mikro diseksiyon, doku hazırlanması ve kültür beyin hasat içerir. Hasat doku ilk kez tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve nihayet NSA kaplama kimyasal MGK orta tripsin-EDTA ve daha sonra mekanik olarak ayrışmış kullanılarak sindirilir. Kültür 7-10 gün sonra ortaya çıkan birincil neurospheres altkültürün gelecek deneyler için gerekli olan hücrelerin miktarı ulaşmak için hazırız.
Protocol
Discussion
Neurosphere tahlil 2 MSS 4-5 izolasyon ve NSC'lerde çalışma için değil, aynı zamanda meme 6 ve 7 kalp gibi birçok dokulardan varsayılan kök hücrelerin, diğer türlerinin izolasyonu için sadece araştırma topluluğu geniş dikkat çekti. beyin, meme ve kolon tümör kök hücreler bu kültür sistemi, somatik ve vücutta tümör habercisi hücre popülasyonlarının bir dizi uygulanabilir olduğunu düşündüren 8-9 belirlenmesi için . Bu yöntemin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Overstreet Vakfı parasal destek verdi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
