Это видео демонстрирует протокол neurosphere метод анализа для создания и расширения нервные стволовые клетки из взрослых региона перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere.
Выделение и расширение предполагаемого нервные стволовые клетки (NSCs) от взрослых мышиных мозга была впервые описана Рейнольдса и Вайс в 1992 году использовании определенного химического бессывороточной культуре системы, известной как neurosphere анализа (NSA). В данном анализе большинства дифференцированных типов клеток умирают в течение нескольких дней культуры, но небольшая популяция реагирует фактор роста клеток-предшественников подвергаются активной пролиферации в присутствии эпидермального фактора роста (ЭФР) и / основной фактор роста фибробластов (bFGF). Эти клетки образуют колонии недифференцированных клеток, называемых нейросферы, который, в свою очередь, может быть субкультивировали расширить пул нервные стволовые клетки. Более того, клетки могут вызвать их дифференцировку, создавая трех основных типов клеток центральной нервной системы, т.е. нейроны, астроциты и олигодендроциты. Этот препарат обеспечивает бесценным инструментом для питания последовательными, возобновляемый источник недифференцированных предшественников ЦНС, которые могут быть использованы для экстракорпорального исследований, а также в лечебных целях.
Это видео демонстрирует метод АНБ для создания и расширения NSCs от взрослого регионе перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка мозг от взрослой мыши, микро-рассечение перивентрикулярной области, подготовки ткани и культуры в АНБ. Собрано ткани первой химически переваривается использованием трипсина-EDTA и затем механически диссоциированных в среде НСК для достижения суспензии отдельных клеток и, наконец, помещают в АНБ. Через 7-10 дней в культуре, в результате первичного нейросферы готовы к субкультуре достичь количества клеток, необходимых для будущих экспериментов.
Neurosphere анализа 2 получила широкое внимание в научное сообщество не только для выделения и изучения NSCs из ЦНС 4-5, но и для выделения других типов предполагаемых стволовых клеток из различных тканей, таких как рак молочной железы 6 и 7 и сердце для идентификации мозг?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.