A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Это видео демонстрирует протокол neurosphere метод анализа для создания и расширения нервные стволовые клетки из взрослых региона перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere.

Abstract

Выделение и расширение предполагаемого нервные стволовые клетки (NSCs) от взрослых мышиных мозга была впервые описана Рейнольдса и Вайс в 1992 году использовании определенного химического бессывороточной культуре системы, известной как neurosphere анализа (NSA). В данном анализе большинства дифференцированных типов клеток умирают в течение нескольких дней культуры, но небольшая популяция реагирует фактор роста клеток-предшественников подвергаются активной пролиферации в присутствии эпидермального фактора роста (ЭФР) и / основной фактор роста фибробластов (bFGF). Эти клетки образуют колонии недифференцированных клеток, называемых нейросферы, который, в свою очередь, может быть субкультивировали расширить пул нервные стволовые клетки. Более того, клетки могут вызвать их дифференцировку, создавая трех основных типов клеток центральной нервной системы, т.е. нейроны, астроциты и олигодендроциты. Этот препарат обеспечивает бесценным инструментом для питания последовательными, возобновляемый источник недифференцированных предшественников ЦНС, которые могут быть использованы для экстракорпорального исследований, а также в лечебных целях.

Это видео демонстрирует метод АНБ для создания и расширения NSCs от взрослого регионе перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка мозг от взрослой мыши, микро-рассечение перивентрикулярной области, подготовки ткани и культуры в АНБ. Собрано ткани первой химически переваривается использованием трипсина-EDTA и затем механически диссоциированных в среде НСК для достижения суспензии отдельных клеток и, наконец, помещают в АНБ. Через 7-10 дней в культуре, в результате первичного нейросферы готовы к субкультуре достичь количества клеток, необходимых для будущих экспериментов.

Protocol

<p class="jove_title"> Часть 1: Основные создан прежде чем приступить к вскрытию:</p><ol><li> Соответствующий объем полной среды НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно. НСК среда может также быть сделаны в лаборатории на основе КНБ роста состава среды в литературе¹. Если ваша лаборатория не имеет большого опыта работы с созданием среды, мы настоятельно рекомендуем использовать коммерчески доступные среды, которая была под контролем качества для NSCs роста до того, как продается (как это имеет место для NeuroCult, Technolgies стволовых клеток).</li><li> Средний разогревается в 37 ° С водяной бане.</li><li> Холодная HEPES буфером минимальной необходимой среде (ВЭМ) с высокой концентрацией антибиотиков (10%) получают для вскрытия и стиральные цели. Кроме того, НСК базальной среды с дополнением антибиотиков может также использоваться для этой цели.</li><li> 30-40 мл холодной HEM, содержащие антибиотики разливают в стерильные 50 мл пробирки для мозга коллекции.</li><li> Несколько 10см пластиковые чашки Петри необходимо провести мозг во время вскрытия и одного 10 см стерильной стеклянной чашки Петри держать расчлененным ткани.</li><li> Хирургические инструменты, необходимые для удаления головного мозга (большие ножницы, маленькие ножницы отметил, большие щипцы, маленькие изогнутые щипцы, и маленький шпатель) или рассечение тканей (маленькие щипцы, изогнутая тонкая щипцы и скальпель) стерилизуют использованием стеклянных бус стерилизатор при 250 ° С или другим доступным методам автоклаве.</li><li> Вскрытие микроскоп протирают 70% спиртом и создать внутри капота PC2.</li></ol><p class="jove_title"> Часть 2: Уборочная взрослом мозге мыши и микро-рассечение:</p><ol><li> 2-4 взрослых (5-8 недель) мышей под наркозом в соответствии со своими институциональными утвержденным животных протокол, используя 3-4% изофлуран или внутри-перитонеального введение фенобарбитала (120 мг / кг).</li><li> Шейки дислокации осуществляется, чтобы убедиться, животное не страдать от боли и страданий.</li><li> Наркозом мыши сделан на ее живот на фильтровальной бумаги ткани, а голову промывают 70% этанолом для стерилизации области.</li><li> Большие ножницы используются для обезглавить животное чуть выше шейного отдела спинного области мозга.</li><li> Малый указал ножницы используются, чтобы сделать средний хвостового-ростральная вырезать и подвергать черепа.</li><li> Обрезанными краями кожи используются для хранения головы, а затем каждое лезвие маленькие ножницы помещается в каждой орбитальной полости, чтобы сделать корональных разрез между орбитами.</li><li> Использование большого затылочного отверстия в качестве отправной точки, продольный разрез производится через череп вдоль стреловидного шва и две боковые разрезы также делаются на стыке боковой стены и основания черепа. Внимание должно быть принято, чтобы не повредить основные мозга, делая небольшие порезы и обеспечение угол лопастей, как мелкий насколько это возможно.</li><li> Черепа вышележащих каждом полушарии захватывается и очищенные наружу использованием изогнутых щипцов подвергать мозг, то с помощью небольшой смоченный шпатель, мозг черпали в 50 мл пробирку HEM.</li><li> Эта процедура повторяется, пока все мозги были собраны.</li><li> Мозг передаются на капот PC2 и промывают три раза с достаточным объемом холодного стерильного HEM для удаления возможных загрязнений, как кровь и волосы. Мозги затем перевели в 10 см блюдо Петри, содержащих ЭМ.</li><li> Чтобы вскрыть области переднего мозга перивентрикулярной, блюдо с мозгом помещается под микроскоп рассекает с низким увеличением. Мозги то позиционируется плашмя на их нижней поверхности и проходить с хвостовой стороны с использованием тонких изогнутых щипцов. Другой набор изогнутых щипцов используется для удаления обонятельных луковиц.</li><li> После удаления обонятельных луковиц, мозги повернуты подвергать вентральной аспект.</li><li> 90 ° корональных надрез на уровне зрительных нервов и хвостового аспекты мозги, отбрасываются.</li><li> Эта процедура повторяется, пока все мозги подразделяются.</li><li> При большем увеличении, ростральной аспекты мозги повернуты так, чтобы поверхность среза лица вверх. Во-первых, перегородка удаляется и отбрасываются с помощью тонкой изогнутой микро-ножницы или изогнутые, заостренные щипцы, а затем тонким слоем ткани, окружающие боковой стенки желудочков режется, за исключением полосатого паренхимы и мозолистого тела. Расчлененный ткани объединены в 10 см стерильную чашку Петри стекла.</li><li> Эта процедура повторяется, пока все мозги микро-расчленены.</li></ol><p class="jove_title"> Часть 3: Подготовка тканей и покрытий клеток:</p><ol><li> Объединенные ткани фарш в течение 1-2 минут, используя лезвие скальпеля, пока только очень маленькие кусочки остались.</li><li> Общим объемом 3 мл 0,05% трипсина-EDTA используется и все измельченной ткани переносят в 15-мл трубки. 3 мл трипсина-EDTA достаточно для хорошего пищеварения тканей найденным до 8 мышей.</li><li> Трубки выдерживают в течение 7 мин при 37 ° С водяной бане.</li><li> В конце ферментативных инкубации, трубка возвращается в капот и равный объем соевого ингибитора трипсина добавляется, чтобы остановить трипсина деятельности.</li><li> Суспензии пипеткой вверх и вниз для обеспечения инактивации трипсина, а затем осаждали центрифугированием при 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин.</li><li> Супернатант отбрасывают, а ткани куски ресуспендировали в 150 мкл стерильной среде базальной НСК. Сброс пипетка до 200 мкл, скопления разобщены, осторожно пипетирования вверх и вниз (3-7 раза) до получения однородной молочно суспензии отдельных клеток достигается. Число pippetting шаги напрямую зависит от размера частиц в измельченной ткани (лучше, чтобы фарш ткани в очень маленькие части, чтобы увеличить площадь поверхности для активности трипсина). Длительные и энергичной механической диссоциации может привести к снижению образования сферы из-за нейронных стволовых и смерть клеток-предшественников.</li><li> Для удаления мусора и не-диссоциированных частей, базальной среды НСК добавляется диссоциированных клеточной суспензии для достижения общего объема 10-15мл. Клеточной суспензии пропускают через сито 40 мкм клетки в соответствующий размер трубы, а затем осаждали центрифугированием при 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин.</li><li> Для дальнейшего удаления мусора, рекомендуется для ресуспендирования гранул в 10-15 мл среды НБК и центрифуги клеточной суспензии при 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин.</li><li> Супернатант отбрасывается. Затем клетки ресуспендировали в соответствующий объем полной среде НСК дополнен 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF и 1μl/ml 0,2% гепарина.</li><li> Диссоциированных тканей от одного мозга помещают в колбу один T25 (содержащий 5 мл полной среды). Затем клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО₂ В течение 7-10 дней и к этому времени должны нейросферы сформировали. Ткань собран из одного мозга обычно могут генерировать 400-600 нейросферы.</li></ol><p class="jove_title"> Часть 4: пассажей и расширение NSCs:</p><ol><li> Когда нейросферы готовы к субкультуре (150-200 мкм в диаметре), среда с приостановлено сферы удаляется из колбы, размещенные в соответствующих размеров стерильную пробирку культуре ткани, и центрифугировали со скоростью 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.</li><li> Супернатант отбрасывается и сфер ресуспендируют в 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА. Кроме того, нейросферы можно пассировать с использованием механических или химических диссоциации методов, описанных в литературе^2,3.</li><li> Клеточной суспензии инкубировали при 37 ° С на водяной бане в течение 2-3 мин, затем равный объем соевого ингибитора трипсина используется для остановки трипсина деятельности.</li><li> Клеточной суспензии осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы трипсина был полностью инактивируется.</li><li> Клеточной суспензии центрифугируют при 700 оборотов в минуту в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли, а клетки ресуспендируют в 1 мл среды НСК.</li><li> 10 мкл клеточной суспензии смешивается с 90μl трипановой синий выполнять клеток.</li><li> Клетки высевали в концентрации 5×10⁴ Клеток / мл в полной среде НСК дополнен 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF и 1μl/ml 0,2% гепарина в соответствующую колбу культуре ткани размером. Используйте 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колб.</li><li> Вторичный нейросферы формируются в течение 5-7 дней, когда инкубировали при 37 ° С в увлажненной инкубаторе с 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> Часть 5: Представитель Результаты:</p><p class="jove_content"> В первичной культуре взрослых НСК, большинство клеток умрет через 2-3 дней, но фактор роста реагировать предшественника (в том числе стволовых и прогениторных клеток) клетки, будет расти (рис. 1) и генерировать колоний недифференцированных клеток через 6-8 дней. В этих культурах значительное количество мусора, как правило, подарок, который могут приобрести сферическую форму, и может быть ошибочно принято за нейросферы. Количество мусора напрямую зависит от микро-рассечение и методы подготовки ткани. Правда нейросферы фазе яркий (светящийся) и становятся более сферическими как размер увеличивается (см. видео). Через 7-10 дней, сферы должны быть округлыми, но не сжимаются, и должны измерить от 150 до 200 мкм, а также должны иметь жесткую микро-шипы на периферии при большом увеличении (рис. 2). Если нейросферы могут расти слишком большими, они становятся темного цвета из-за гибели клеток в центре сферы. Большой нейросферы трудно отделить и в конце концов начинают прикрепляться к субстрату и дифференцировать.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /<strong> Рисунок 1.</strong> Первичные взрослых НСК культуры через 3 дня после металлизации. Стрелками показаны небольшие колонии пролиферативной NSCs. Оригинальные Увеличение; 20x.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /<strong> Рисунок 2.</strong> Прохождение одного взрослого neurosphere 7 дней после покрытия. Обратите внимание, микро-шипы на периферии области. Оригинальные Увеличение; 20x.</p

Discussion

Neurosphere анализа ² получила широкое внимание в научное сообщество не только для выделения и изучения NSCs из ЦНС ^4-5, но и для выделения других типов предполагаемых стволовых клеток из различных тканей, таких как рак молочной железы ⁶ и ⁷ и сердце для идентификации мозг?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.