Summary
Questo protocollo video viene illustrato il metodo di analisi per generare neurosfere ed espandere le cellule staminali neurali adulte provenienti dalla regione periventricolare del mouse, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile.
Abstract
L'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali putativo (NSC) dal cervello adulto murino è stato descritto da Reynolds e Weiss nel 1992 utilizzando una chimica definita senza siero sistema di coltura noto come il test neurosfere (NSA). In questo saggio, la maggior parte dei tipi di cellule differenziate morire entro pochi giorni di cultura, ma una piccola popolazione di cellule precursori fattore di crescita sensibili sottoposti attiva proliferazione in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e / base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Queste cellule formano colonie di cellule indifferenziate chiamate neurosfere, che a sua volta può essere reinoculate per espandere il pool di cellule staminali neurali. Inoltre, le cellule possono essere indotte a differenziarsi, generando le tre principali tipi di cellule del sistema nervoso centrale cioè neuroni, astrociti e oligodendrociti. Questo test fornisce un prezioso strumento per fornire una costante, fonte rinnovabile di precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbero essere utilizzati per studi in vitro e anche per scopi terapeutici.
Questo video viene illustrato il metodo NSA per generare ed espandere NSCs dalla regione periventricolare topo adulto, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta del cervello da topo adulto, micro-dissezione della regione periventricolare, preparazione dei tessuti e della cultura nella NSA. Il tessuto raccolto viene prima digerito chimicamente con tripsina-EDTA e poi dissociato meccanicamente in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcato in NSA. Dopo 7-10 giorni in coltura, la risultante neurosfere primarie sono pronti per la sottocultura di raggiungere la quantità di cellule necessario per gli esperimenti futuri.
Protocol
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Discussion
Il test neurosfere 2 ha guadagnato l'attenzione generale della comunità di ricerca non solo per l'isolamento e lo studio di NSCs da SNC 4-5, ma anche per l'isolamento di altri tipi di cellule staminali provenienti da tessuti diversi putativo, come il petto 6 e 7 e cuore per l'identificazione del cervello, della mammella e del colon cellule staminali tumorali 8-9 suggerendo che questo sistema di coltura può essere applicato a una serie di somatiche e le popolazioni precursore delle cellule tumorali in tutto il corpo. Alcuni dei vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità, la riproducibilità e la generazione di un numero indefinito di cellule da un piccolo pezzo di tessuto o anche un piccolo numero di cellule in una struttura chimica definita media i livelli di free.
Va sottolineato che il numero di neurosfere nella cultura non rappresenta il numero di cellule staminali come neurosfere possono essere derivati sia da cellule staminali in buona fede o da più cellule progenitrici ristretta 10. A questo proposito un test è stato sviluppato per enumerare correttamente NSCs nella cultura 11.
Diversi metodi sono utilizzati per dissociarsi neurosfere in sospensione singola cella compresi i metodi meccanici ed enzimatiche. Sebbene il metodo meccanico è l'originale metodo di neurosfere dissociazione 2, richiede molta esperienza e la sua efficienza varia a seconda dell'operatore. Questo metodo può anche causare la morte cellulare e danni significativi se applicato da un individuo inesperto, che può ridurre l'accuratezza delle analisi che si basano su neurosfere dissociazione 3. Tripsina-EDTA dissociazione enzimatica ha anche alcuni vantaggi e svantaggi. Dissociazione enzimatica delle neurosfere è facile, efficiente e riproducibile, se effettuata per la lunghezza appropriata del tempo e sulla destra neurosfere dimensioni. Anche se non esistono studi fianco a fianco a confronto gli effetti di questi due metodi di neurosfere dissociazione, la nostra esperienza dimostra che una incubazione breve (3-5 minuti) del neurosfere (fino a 250 micron) con tripsina-EDTA risultati in modo efficiente dissociazione senza disturbare le loro capacità vitalità, proliferazione e differenziazione. D'altra parte, una lunga esposizione di neurosfere (soprattutto per i grandi invasi neurosfere) di tripsina-EDTA potrebbe causare seri danni ai recettori della superficie cellulare, la digestione e la morte delle cellule potenzialmente cellulare. Sovraesposizione alla tripsina-EDTA potrebbe anche interferire con la formazione di sfera e le cellule causa di allegare al substrato e differenziare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
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- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
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- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
