Summary
Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.
Abstract
Isolatie en uitbreiding van de vermeende neurale stamcellen (NSCs) van de volwassen muizen hersenen werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss in 1992 in dienst een chemisch welbepaalde serum-vrije cultuur dat bekend staat als de neurosphere assay (NSA). In deze test, de meerderheid van de gedifferentieerde celtypen sterven binnen een paar dagen cultuur, maar een kleine populatie van de groeifactor responsieve voorloper cellen ondergaan actief proliferatie in de aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF) en / basic fibroblastische groeifactor (bFGF). Deze cellen vormen kolonies van ongedifferentieerde cellen genaamd neurospheres, die op hun beurt kunnen worden subcultuur naar het zwembad van neurale stamcellen uit te breiden. Bovendien kunnen de cellen worden geïnduceerd om te differentiëren, het genereren van de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Deze test geeft een waardevol instrument om een consistente, duurzame bron van ongedifferentieerde CNS precursoren, die kunnen worden gebruikt voor in vitro studies en ook voor therapeutische doeleinden te leveren.
Deze video toont de NSA methode te genereren en uit te breiden NSCs van de volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken. De procedure omvat het oogsten van de hersenen van de volwassen muis, micro-dissectie van de periventriculaire regio, het prepareren van weefsels en cultuur in de NSA. De geoogste weefsel wordt eerst chemisch verteerd met behulp van trypsine-EDTA en vervolgens mechanisch gedissocieerd in NSC medium om een enkele celsuspensie te bereiken en uiteindelijk uitgeplaat in de NSA. Na 7-10 dagen in de cultuur, de resulterende primaire neurospheres zijn klaar voor subcultuur om de hoeveelheid cellen die nodig is voor toekomstige experimenten te bereiken.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De neurosphere assay 2 heeft opgedaan ruime aandacht in het onderzoek gemeenschap niet alleen voor de isolatie en de studie van NSCs van CNS 4-5, maar ook voor de isolatie van andere soorten vermeende stamcellen uit een groot aantal weefsels, zoals borst-6 en 7 en het hart voor de identificatie van de hersenen, borst-en dikke darm tumor stamcellen 8-9 suggereert dat deze cultuur systeem kan worden toegepast op een aantal van de somatische en tumor precursor celpopulaties door het hele lichaam. Enkele van de voordelen van deze methode zijn onder meer de eenvoud, reproduceerbaarheid en het genereren van onbepaald aantal cellen van een klein stukje weefsel of zelfs een klein aantal cellen in een chemisch welbepaalde serum vrij medium.
Benadrukt moet worden dat het aantal neurospheres in de cultuur niet het aantal stamcellen te stellen als neurospheres kan worden afgeleid uit zowel bonafide stamcellen of uit meer beperkt progenitorcellen 10. In dit opzicht een test is ontwikkeld om de juiste sommen NSCs in de cultuur 11.
Verschillende methoden worden gebruikt om neurospheres in enkele celsuspensie met inbegrip van mechanische en enzymatische methoden dissociëren. Hoewel de mechanische methode is de oorspronkelijke neurosphere dissociatie methode 2, het vereist veel ervaring en zijn efficiëntie is afhankelijk van de operator. Deze methode kan ook leiden tot aanzienlijke celdood en schade indien toegepast door een onervaren persoon, die de juistheid van de analyses die vertrouwen op neurosphere dissociatie 3 kan verminderen. Trypsine-EDTA enzymatische dissociatie heeft ook een aantal voor-en nadelen. Enzymatische dissociatie van neurospheres is eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar, indien uitgevoerd voor de juiste lengte van de tijd en op de juiste maat neurospheres. Hoewel er geen studies naast elkaar vergelijken van de effecten van deze twee methoden van neurosphere dissociatie, onze ervaring leert dat een korte incubatietijd (3-5 minuten) van de neurospheres (tot 250 micrometer) met trypsine-EDTA resulteert in een efficiënte dissociatie zonder verstoring van hun levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie mogelijkheden. Aan de andere kant kan lange blootstelling van neurospheres (vooral voor de grote overwoekerde neurospheres) naar trypsine-EDTA veroorzaken ernstige schade aan de receptoren op het celoppervlak, cel spijsvertering en potentieel celdood. Overmatige blootstelling aan trypsine-EDTA kan ook interfereren met een bol vorming en veroorzaken cellen te hechten aan de ondergrond en te differentiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
