Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay
Summary
Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.
Abstract
Isolatie en uitbreiding van de vermeende neurale stamcellen (NSCs) van de volwassen muizen hersenen werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss in 1992 in dienst een chemisch welbepaalde serum-vrije cultuur dat bekend staat als de neurosphere assay (NSA). In deze test, de meerderheid van de gedifferentieerde celtypen sterven binnen een paar dagen cultuur, maar een kleine populatie van de groeifactor responsieve voorloper cellen ondergaan actief proliferatie in de aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF) en / basic fibroblastische groeifactor (bFGF). Deze cellen vormen kolonies van ongedifferentieerde cellen genaamd neurospheres, die op hun beurt kunnen worden subcultuur naar het zwembad van neurale stamcellen uit te breiden. Bovendien kunnen de cellen worden geïnduceerd om te differentiëren, het genereren van de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Deze test geeft een waardevol instrument om een consistente, duurzame bron van ongedifferentieerde CNS precursoren, die kunnen worden gebruikt voor in vitro studies en ook voor therapeutische doeleinden te leveren.
Deze video toont de NSA methode te genereren en uit te breiden NSCs van de volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken. De procedure omvat het oogsten van de hersenen van de volwassen muis, micro-dissectie van de periventriculaire regio, het prepareren van weefsels en cultuur in de NSA. De geoogste weefsel wordt eerst chemisch verteerd met behulp van trypsine-EDTA en vervolgens mechanisch gedissocieerd in NSC medium om een enkele celsuspensie te bereiken en uiteindelijk uitgeplaat in de NSA. Na 7-10 dagen in de cultuur, de resulterende primaire neurospheres zijn klaar voor subcultuur om de hoeveelheid cellen die nodig is voor toekomstige experimenten te bereiken.
Protocol
Discussion
De neurosphere assay 2 heeft opgedaan ruime aandacht in het onderzoek gemeenschap niet alleen voor de isolatie en de studie van NSCs van CNS 4-5, maar ook voor de isolatie van andere soorten vermeende stamcellen uit een groot aantal weefsels, zoals borst-6 en 7 en het hart voor de identificatie van de hersenen, borst-en dikke darm tumor stamcellen 8-9 suggereert dat deze cultuur systeem kan worden toegepast op een aantal van de somatische en tumor precursor celpopul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
