Summary
Este protocolo de vídeo se muestra el método de ensayo neuroesfera para generar y expandir las células madre neurales de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurarse de que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible.
Abstract
El aislamiento y la expansión de las células madre neurales putativo (NSC) del cerebro murino adulto fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss en 1992, empleando una química definida libre de suero sistema de cultivo conocido como ensayo neuroesfera (NSA). En este ensayo, la mayoría de los tipos de células diferenciadas mueren a los pocos días de la cultura, sino una pequeña población de células precursoras del factor de crecimiento de respuesta experimentan una proliferación activa en presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Estas células forman colonias de células indiferenciadas llamadas neuroesferas, que a su vez puede ser un subcultivo para ampliar el grupo de células madre neurales. Por otra parte, las células pueden ser inducidas a diferenciarse, generar los tres tipos principales de células de las neuronas del SNC, es decir, astrocitos y oligodendrocitos. Este ensayo proporciona una valiosa herramienta para proporcionar una fuente constante y renovable de los precursores del SNC no diferenciadas, que podrían ser utilizados para estudios in vitro y también con fines terapéuticos.
Este video muestra el método NSA para generar y ampliar NSCs de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurar que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la extracción del cerebro del ratón adulto, micro-disección de la región periventricular, la preparación del tejido y la cultura de la NSA. El tejido es la primera cosecha químicamente digerido con tripsina-EDTA y luego disociado mecánicamente en un medio de NSC para lograr una suspensión de células individuales y, finalmente, se sembraron en la NSA. Después de 7-10 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes están listos para la subcultura de llegar a la cantidad de celdas requeridas para futuros experimentos.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ensayo neuroesfera 2 ha ganado gran atención en la comunidad de investigación no sólo para el aislamiento y estudio de los comités directivos de la CNS 05/04, sino también para el aislamiento de otros tipos de células madre putativa de numerosos tejidos, como el de mama 6 y 7 y el corazón para la identificación de cerebro, mama y colon células madre tumorales 8-9 lo que sugiere que este sistema de cultivo se puede aplicar a una serie de síntomas somáticos y el tumor de las poblaciones de células precursoras a través del cuerpo. Algunas de las ventajas de este método son su sencillez, reproducibilidad y la generación de número indeterminado de células de un pequeño trozo de tejido o incluso un pequeño número de células en un medio químicamente definido libre de suero.
Cabe destacar que el número de neuroesferas en la cultura no representa el número de células madre como neuroesferas se pueden derivar ya sea de buena fe o las células madre a partir de células progenitoras más restringida 10. A este respecto, un ensayo ha sido desarrollado para enumerar correctamente NSCs en la cultura 11.
Se utilizan diferentes métodos para disociar neuroesferas en suspensión de células individuales incluyendo los métodos mecánicos y enzimáticos. Aunque el método mecánico es el método original de disociación neuroesfera 2, se requiere de mucha experiencia y su eficacia varía según el operador. Este método también puede causar la muerte celular y daño si se aplica a una persona sin experiencia, lo cual puede disminuir la precisión de los ensayos que se basan en la disociación neuroesfera 3. Tripsina-EDTA disociación enzimática también tiene algunas ventajas y desventajas. Enzimático de disociación de neuroesferas es fácil, eficiente y reproducible si se realiza para el periodo de tiempo adecuado y en el neuroesferas tamaño adecuado. Aunque no hay estudios de lado a lado la comparación de los efectos de estos dos métodos de neuroesfera disociación, nuestra experiencia muestra que una incubación breve (3-5 minutos) de las neuroesferas (hasta 250 m) con tripsina-EDTA resultados de manera eficiente la disociación sin afectar su capacidad de viabilidad, proliferación y diferenciación. Por otro lado, la exposición prolongada de neuroesferas (especialmente para las neuroesferas cubierto de gran tamaño) a la tripsina-EDTA podría causar graves daños a los receptores de superficie celular, la digestión celular y potencialmente la muerte celular. La sobreexposición a la tripsina-EDTA también pueden interferir con la formación de la esfera y las células de la causa para unir al sustrato y se diferencian.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
