El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera
Summary
Este protocolo de vídeo se muestra el método de ensayo neuroesfera para generar y expandir las células madre neurales de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurarse de que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible.
Abstract
El aislamiento y la expansión de las células madre neurales putativo (NSC) del cerebro murino adulto fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss en 1992, empleando una química definida libre de suero sistema de cultivo conocido como ensayo neuroesfera (NSA). En este ensayo, la mayoría de los tipos de células diferenciadas mueren a los pocos días de la cultura, sino una pequeña población de células precursoras del factor de crecimiento de respuesta experimentan una proliferación activa en presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Estas células forman colonias de células indiferenciadas llamadas neuroesferas, que a su vez puede ser un subcultivo para ampliar el grupo de células madre neurales. Por otra parte, las células pueden ser inducidas a diferenciarse, generar los tres tipos principales de células de las neuronas del SNC, es decir, astrocitos y oligodendrocitos. Este ensayo proporciona una valiosa herramienta para proporcionar una fuente constante y renovable de los precursores del SNC no diferenciadas, que podrían ser utilizados para estudios in vitro y también con fines terapéuticos.
Este video muestra el método NSA para generar y ampliar NSCs de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurar que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la extracción del cerebro del ratón adulto, micro-disección de la región periventricular, la preparación del tejido y la cultura de la NSA. El tejido es la primera cosecha químicamente digerido con tripsina-EDTA y luego disociado mecánicamente en un medio de NSC para lograr una suspensión de células individuales y, finalmente, se sembraron en la NSA. Después de 7-10 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes están listos para la subcultura de llegar a la cantidad de celdas requeridas para futuros experimentos.
Protocol
Discussion
El ensayo neuroesfera 2 ha ganado gran atención en la comunidad de investigación no sólo para el aislamiento y estudio de los comités directivos de la CNS 05/04, sino también para el aislamiento de otros tipos de células madre putativa de numerosos tejidos, como el de mama 6 y 7 y el corazón para la identificación de cerebro, mama y colon células madre tumorales 8-9 lo que sugiere que este sistema de cultivo se puede aplicar a una serie de síntomas somáti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
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- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
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