절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장
Summary
이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.
Abstract
성인 murine 두뇌에서 putative 신경 줄기 세포 (NSCs)의 분리 및 확장 먼저 neurosphere 분석 (NSA)으로 알려진 화학적으로 정의된 혈청 무료 문화 시스템을 채용 1992 년 레이놀즈와 바이스에 의해 설명되었다. 이 분석에서 차별화된 세포 유형의 대부분이 문화의 몇 일 이내에 죽을 성장 인자 반응 전구체 세포의 작은 인구는 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 기본 fibroblastic 성장 인자 (bFGF)의 존재에서 활약 확산을 받고있다. 이러한 세포가 차례로 신경 줄기 세포의 수영장을 확장 subcultured 수 있습니다 neurospheres 불리는 undifferentiated 세포의 콜로니를 형성하고 있습니다. 또한, 세포는 CNS의 즉, 뉴런, astrocytes, oligodendrocytes 및의 세 가지 주요 세포 유형을 생성 차별화하는 유도하실 수 있습니다. 이 분석은 체외 연구에서 또한 치료 목적으로 사용할 수 undifferentiated CNS의 엽 성의 전구 물질의 일관성 재생 소스를 제공하는 소중한 도구를 제공합니다.
이 비디오는 성인 마우스 periventricular 지역에서 NSCs를 생성하고 확장하는 NSA 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다. 절차는 NSA의 성인 마우스, periventricular 지역의 미세 해부, 조직 준비와 문화의 머리를 수확이 포함되어 있습니다. 수확 조직 처음 화학적으로 단일 세포 현탁액을 달성하고 마지막으로 NSA의 도금에 NSC 매체에서 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 그리고 기계 dissociated를 사용하여 소화됩니다. 문화 70~10일 후, 그 결과 기본 neurospheres 앞으로 실험에 필요한 세포의 양을 도달 subculture에 대한 준비가되어 있습니다.
Protocol
Discussion
neurosphere 분석 2 CNS 4-5에서 고립과 NSCs의 연구뿐 아니라 유방 6과 마음 7 등 많은 조직에서 putative 줄기 세포의 다른 종류의 격리를 위해뿐만 아니라 연구 커뮤니티의 광범위한 관심을 얻게하고있다 뇌, 유방 및 결장 종양의 줄기 세포이 문화 시스템은 체세포와 체내 종양 전구체 세포 집단의 숫자에 적용할 수있는 제안 8-9의 식별. 이 방법의 장점 중 일부는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
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