Summary
이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.
Abstract
성인 murine 두뇌에서 putative 신경 줄기 세포 (NSCs)의 분리 및 확장 먼저 neurosphere 분석 (NSA)으로 알려진 화학적으로 정의된 혈청 무료 문화 시스템을 채용 1992 년 레이놀즈와 바이스에 의해 설명되었다. 이 분석에서 차별화된 세포 유형의 대부분이 문화의 몇 일 이내에 죽을 성장 인자 반응 전구체 세포의 작은 인구는 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 기본 fibroblastic 성장 인자 (bFGF)의 존재에서 활약 확산을 받고있다. 이러한 세포가 차례로 신경 줄기 세포의 수영장을 확장 subcultured 수 있습니다 neurospheres 불리는 undifferentiated 세포의 콜로니를 형성하고 있습니다. 또한, 세포는 CNS의 즉, 뉴런, astrocytes, oligodendrocytes 및의 세 가지 주요 세포 유형을 생성 차별화하는 유도하실 수 있습니다. 이 분석은 체외 연구에서 또한 치료 목적으로 사용할 수 undifferentiated CNS의 엽 성의 전구 물질의 일관성 재생 소스를 제공하는 소중한 도구를 제공합니다.
이 비디오는 성인 마우스 periventricular 지역에서 NSCs를 생성하고 확장하는 NSA 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다. 절차는 NSA의 성인 마우스, periventricular 지역의 미세 해부, 조직 준비와 문화의 머리를 수확이 포함되어 있습니다. 수확 조직 처음 화학적으로 단일 세포 현탁액을 달성하고 마지막으로 NSA의 도금에 NSC 매체에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 그리고 기계 dissociated를 사용하여 소화됩니다. 문화 70~10일 후, 그 결과 기본 neurospheres 앞으로 실험에 필요한 세포의 양을 도달 subculture에 대한 준비가되어 있습니다.
Protocol
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Discussion
neurosphere 분석 2 CNS 4-5에서 고립과 NSCs의 연구뿐 아니라 유방 6과 마음 7 등 많은 조직에서 putative 줄기 세포의 다른 종류의 격리를 위해뿐만 아니라 연구 커뮤니티의 광범위한 관심을 얻게하고있다 뇌, 유방 및 결장 종양의 줄기 세포이 문화 시스템은 체세포와 체내 종양 전구체 세포 집단의 숫자에 적용할 수있는 제안 8-9의 식별. 이 방법의 장점 중 일부는 단순, 재현성 및 조직의 작은 조각 또는 화학적으로 정의 혈청 무료 매체 세포도 소수의 세포의 무기한 번호 생성이 포함됩니다.
그것은 neurospheres는 타고난 줄기 세포에서 이상 제한 전구 세포에서 10 중 파생 수 있듯이 문화에 neurospheres의 수가 줄기 세포의 수를 나타냅니다하지 않는 강조해야합니다. 이런 점에서 분석이 올바르게 문화 11 NSCs를 열거하기 위해 개발되었습니다.
다른 방법은 기계 및 효소 방법을 포함하는 단일 세포 현탁액에 neurospheres를 떼어 놓다하는 데 사용됩니다. 기계적 방법은 원래 neurosphere 분리 방법 2이지만, 많은 경험을 필요로하고 효율성은 연산자에 따라 다릅니다. neurosphere 분리 3 의존 assays의 정확성을 줄일 수있는 경험이 개인에 의해 적용하는 경우이 방법은 또한 중요한 세포 죽음과 손상을 줄 수 있습니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 효소 분리는 또한 몇 가지 장점과 단점이 있습니다. 시간의 적절한 길이와 오른쪽 크기 neurospheres에서 수행하는 경우 neurospheres의 효소 분해가 쉽고 효율적이고 재현할 수 있습니다. neurosphere 분리 이러한 두 가지 방법의 효과를 비교 사이드 연구에 의해 더 사이드가 없지만, 우리의 경험이 보여주는 효율적인 분리에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 결과 neurospheres의 간단한 부화 (3-5 분) (최대 250 μm의) 그들의 생존, 증식 및 분화 능력을 방해하지 않고. 한편, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 neurospheres의 긴 노출은 (특히 큰 자란 neurospheres)을 세포 표면 수용체, 세포 소화 잠재적으로 세포 사망에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 노출 과도 또한 기판에 연결하고 차별화하는 영역의 형성과 원인 세포 방해 수도 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
