Summary
Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.
Abstract
Isolation und Expansion der vermeintlichen neuralen Stammzellen (NSCs) aus der erwachsenen Mäuse-Gehirn wurde zuerst von Reynolds und Weiss im Jahr 1992 beschrieben unter Verwendung eines chemisch definierten serumfreien System als Neurosphäre Assay (NSA) bekannt. In diesem Test, sterben die meisten differenzierte Zelltypen innerhalb weniger Tage der Kultur, sondern eine kleine Population von Wachstumsfaktor reagieren Vorläuferzellen unterziehen aktive Proliferation in Anwesenheit des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und / basic Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Diese Zellen bilden Kolonien von undifferenzierten Zellen, die sogenannten Neurosphären, was wiederum subkultiviert, um den Pool der neuralen Stammzellen erweitern können. Darüber hinaus können die Zellen induziert, um zu unterscheiden, die Erzeugung der drei großen Zelltypen des ZNS, dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Dieser Test liefert ein wertvolles Werkzeug, um eine konsistente, erneuerbare undifferenzierten ZNS-Vorstufen, die in vitro-Studien und auch für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten versorgen.
Dieses Video zeigt die NSA-Methode zu generieren und zu erweitern NSCs aus der adulten Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung der Gehirn der adulten Maus, Mikro-Dissektion der periventrikulären Region, Gewebe und-kultur in der NSA. Die geernteten Gewebe wird zunächst chemisch verdaut unter Verwendung von Trypsin-EDTA und anschließend mechanisch dissoziiert in NSC Medium auf eine einzelne Zelle Suspension zu erzielen und schließlich in der NSA überzogen. Nach 7-10 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären bereit für Subkultur, die Menge an Zellen für zukünftige Experimente erforderlich zu erreichen.
Protocol
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Discussion
Die Neurosphäre Test 2 hat große Aufmerksamkeit in der Forschung nicht nur für die Isolierung und Untersuchung der NSCs aus CNS 4-5, sondern auch für die Isolierung von anderen Arten von vermeintlichen Stammzellen aus zahlreichen Geweben, wie Brust-6 und Herz 7 gewonnen und für die Identifizierung von Gehirn-, Brust-und Darmkrebs Tumorstammzellen 8-9 darauf hindeutet, dass diese Kultur-System eine Reihe von somatischen und Tumor-Vorläuferzellen Zellpopulationen im ganzen Körper angewendet werden kann. Einige der Vorteile dieser Methode sind ihre Einfachheit, Reproduzierbarkeit und die Erzeugung von unbestimmten Anzahl von Zellen aus einem kleinen Stück Gewebe oder sogar eine kleine Anzahl von Zellen in einem chemisch definierten serumfreien Medium.
Es sollte betont werden, dass die Zahl der Neurosphären in Kultur repräsentieren nicht die Anzahl der Stammzellen als Neurosphären entweder von bona fide Stammzellen oder aus mehr eingeschränkt Vorläuferzellen 10 abgeleitet werden kann. In dieser Hinsicht ein Assay wurde entwickelt, um korrekt aufzählen NSCs in Kultur 11.
Verschiedene Methoden werden verwendet, um Neurosphären in einzelne Zellsuspension einschließlich der mechanischen und enzymatischen Methoden distanzieren. Obwohl mechanische Methode ist die ursprüngliche Neurosphäre Dissoziation Methode 2, bedarf es einer Menge Erfahrung und ihre Effizienz variiert je nach Anbieter. Auch diese Methode kann zu erheblichen Zelltod und Schaden, wenn durch einen unerfahrenen Person, die die Genauigkeit des Assays, die auf Neurosphäre Dissoziation 3 berufen Rückgang angewendet. Trypsin-EDTA enzymatische Spaltung hat auch einige Vorteile und Nachteile. Enzymatische Dissoziation von Neurosphären ist einfach, effizient und reproduzierbar, wenn für die entsprechende Länge der Zeit und auf die richtige Größe Neurosphären durchgeführt. Obwohl es kein Nebeneinander Studien zum Vergleich der Wirkungen dieser beiden Methoden der Neurosphäre Dissoziation sind, zeigt unsere Erfahrung, dass eine kurze Inkubationszeit (3-5 Minuten) der Neurosphären (bis 250 um) mit Trypsin-EDTA führt zu einer effizienten Dissoziation ohne störende ihre Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Differenzierung Fähigkeiten. Auf der anderen Seite könnte lange Belichtungszeiten von Neurosphären (vor allem für die großen verwilderten Neurosphären) Trypsin-EDTA zu schweren Schäden an Rezeptoren auf der Zelloberfläche, Zellaufschluss und möglicherweise zum Zelltod. Überbelichtung zu Trypsin-EDTA könnte auch mit einer Kugel Bildung und verursachen Zellen stören auf das Substrat legen und zu differenzieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
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- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
