Summary
L'applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.
Abstract
Il (o formanti colonie) clonogenica saggio è stato stabilito per più di 50 anni, la carta originale che descrive la tecnica è stata pubblicata nel 1956 1. Oltre a documentare il metodo, lo studio punto di riferimento iniziale generato la prima dose di radiazioni curva di risposta per i raggi X irradiato mammiferi (HeLa), le cellule in coltura 1. Fondamentalmente, il saggio clonogenica consente una valutazione delle differenze di vitalità riproduttiva (capacità delle cellule di produrre progenie, cioè una singola cellula a formare una colonia di 50 o più cellule) tra le cellule di controllo non trattato e le cellule che hanno subito diversi trattamenti come l'esposizione a radiazioni ionizzanti, composti chimici vari (es. agenti citotossici) o in altri casi la manipolazione genetica. Il test è diventata la tecnica più ampiamente accettata in biologia radiazioni ed è stato ampiamente utilizzato per valutare la sensibilità alle radiazioni di diverse linee cellulari. Inoltre, il saggio clonogenica è comunemente usato per monitorare l'efficacia di composti radiazioni modifica e per determinare gli effetti di agenti citotossici e di altre terapie anti-cancro sulla capacità formanti colonie, in diverse linee cellulari. Un tipico esperimento di sopravvivenza clonogenica utilizzando linee di cellule aderenti coinvolge tre componenti distinte, 1) il trattamento del monostrato cellulare in flaconi colture di tessuti, 2) preparazione di sospensioni singola cellula e placcatura un adeguato numero di cellule in piastre di Petri e 3) di fissaggio e colorazione colonie dopo un periodo di incubazione rilevante, che potrebbe variare da 1-3 settimane, a seconda della linea cellulare. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con linee cellulari aderenti con l'utilizzo di una linea cellulare umana immortalata cheratinociti (FEP-1811) 2. Inoltre, i nostri obiettivi sono quelli di descrivere caratteristiche comuni di test clonogenica compreso il calcolo del rendimento della placcatura e le frazioni di sopravvivenza dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni, e per esemplificare la modifica della radiazione-risposta con l'utilizzo di una formulazione antiossidante naturale.
Protocol
1. Cellule Cultura e set-up sperimentale
- Cheratinociti umani sono mantenuti come monostrati in 75 fiaschi tessuto cm 2 di coltura contenente 15 mL di cheratinociti-SFM (K-SFM) media (GIBCO, mezzo privo di siero) arricchito con L-glutamina (2 mm), fattore di crescita epidermico (5 ng / mL), estratto di ipofisi bovina (40 mg / ml) e 20 mg / mL di gentamicina. Le cellule sono coltivate in umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C.
- Le cellule vengono seminate in 12 x 25 cm 2 di tessuto fiasche di coltura contenente 5 ml di K-SFM media.
Sospensioni singola cella sono preparati da tripsinizzazione. Le cellule sono lavate con tampone fosfato e incubate con un 0,05% tripsina / EDTA soluzione per 5-10 minuti. Quando le cellule iniziano a diventare arrotondate e ~ 30% individuale, da 3 volumi di medie Dulbecco modificato aquila contenente il 10% di siero fetale bovino viene aggiunto per neutralizzare la tripsina. Le cellule sono staccati pipettando su e giù (20 volte). Le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro.
Numero di cellule appropriate sono teste di serie in base al tempo di raddoppio della linea cellulare (circa 20 ore per l'uomo FEP-1811 cheratinociti). Lo scopo è quello di raggiungere confluenza ~ 90% (~ 10 6 cellule per cilindro), il giorno dell'esperimento.
Un esperimento composto da 12 fiaschi è ottimale per un singolo test clonogenica (sei controllo irraggiati e sei fiaschi irradiati) che può essere completato in circa quattro ore.
2. Trattamento e irradiazione
- Curare le cellule per un tempo adeguato con un contenuto significativo radiazioni modificando composto ed esporre le cellule a radiazioni ionizzanti o γ-radiazioni o raggi-X.
Tipicamente sei fiaschi servire come efficienza placcatura (non trattato) e controlli unico farmaco. Gli altri sei palloni sono irradiati.
In questo esempio cheratinociti umani sono trattati con varie concentrazioni di Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals integrità internazionale, Spring Hill, TN, Stati Uniti; dati rappresentativi per 20 mg / ml è indicato sotto), una formulazione idrosolubile antiossidante naturale, per 1 ora a 37 ° C. Le cellule sono irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min).
3. Placcatura
- Dopo il trattamento, sospensioni singola cella sono ottenuti come descritto in precedenza.
- Il numero di cellule in ogni campione sono contati con cura utilizzando un emocitometro e diluito in modo tale che il numero di cellule appropriate sono seminati in piastre di Petri (cinque repliche di ciascuno in 15 piatti mm).
La placcatura efficienza e / o sopravvivere frazione dovrebbe essere anticipato al momento di decidere il numero di cellule alle sementi per piastra. Lo scopo è quello di raggiungere una gamma di fra 20 - 150 colonie.
Piastre di Petri sono disposti in una scatola umidificata clonazione di plastica e incubate in un 5% di CO 2 ambiente a 37 ° C per la formazione di colonie.
Il tempo di incubazione per la formazione di colonie varia da 1-3 settimane per le diverse linee cellulari, è accettato che il tempo deve essere pari ad almeno sei divisioni cellulari. In questo esempio, i piatti di controllo per cheratinociti umani richiedono otto giorni per formare cloni sufficientemente ampio costituito da 50 o più celle.
4. Fissaggio e colorazione Colonie
Completare i seguenti passaggi in una cappa aspirante.
- Delicatamente rimuovere il supporto da ciascuna delle piastre per aspirazione.
- Lavare ogni piatto con 5 ml di soluzione salina allo 0,9%.
- Fissare le colonie con 5 ml di soluzione neutra al 10% formalina tamponata per 15-30 minuti.
- Macchia viola con 5 ml 0,01% (w / v) di cristallo nella dH 2 O per 30-60 minuti.
- Lavare viola eccesso di cristallo con dH 2 O e lasciare i piatti ad asciugare.
5. Conteggio delle colonie
Stereomicroscopio
- Colonie contenenti più di 50 celle singole si contano utilizzando uno stereomicroscopio.
Digital imaging e il conteggio utilizzando software di imaging
- Le immagini digitali delle colonie sono ottenuti utilizzando una fotocamera o dispositivo di scansione
- Le colonie sono contate utilizzando l'imaging pacchetti software di analisi come descritto di seguito.
Conta delle cellule usando ImageJ (Fiji versione 1.44a)
- Aprire il file immagine in Fiji, andare su File -> Apri.
- Se necessario convertire l'immagine in formato 8-bit, vai su Immagine -> Regola Soglia ...->.
- Regolare la soglia di ridurre i livelli di non-specifico background in modo che solo le colonie vengono rilevati.
- Contare le colonie con la seguente: andare al processo - Binary> -> Trova maxima.
Per questo formato di immagine, la tolleranza rumore può essere impostato a 0. Assicurarsi che l'opzione di fondo della luce sia selezionata e visualizzare in anteprima i massimi rilevati per verificare che tutte le colonie di cellule sono stati correttamente registrati.
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Discussion
In questo esempio umano FEP-1811 cheratinociti sono stati trattati con diverse concentrazioni fino a 100 mg / ml CPF; dato viene mostrato per 20 mg / mL CPF per 1 ora a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono state irradiate con 4 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Per i trattamenti di controllo non trattato solo di droga e 100 cellule sono state placcate in ogni capsula di Petri e 1000 cellule per piatto sono stati placcati per i campioni irradiati. Come indicato nella tabella sopra, le colonie sono state contate utilizzando uno stereomicroscopio o immagini digitali (Fig. 1) sono stati presi per il conteggio con ImageJ. Il conteggio delle colonie media per i cinque piatti è stato utilizzato per calcolare il rendimento placcatura e la frazione di sopravvivenza. I dati hanno indicato un effetto protettivo di radiazione (fattore di protezione ~ 3) con la formulazione antiossidante naturale.
Rappresentante Risultati
| Trattamento | Metodo di conteggio | Cellulare placcato | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Placcatura Efficiency1 | Sopravvivere Fraction2 |
| Le cellule non trattate | Manuale (Stereomicroscopio) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Manuale (Immagine digitale) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Trova Maxima (Fiji) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | |
| 20 mM CPF | Manuale (Stereomicroscopio) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Manuale (Immagine digitale) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Trova Maxima (Fiji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 0,65 | |
| 4 Gy | Manuale (Stereomicroscopio) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Manuale (Immagine digitale) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Trova Maxima (Fiji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 mM CPF + 4 Gy | Manuale (Stereomicroscopio) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Manuale (Immagine digitale) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Trova Maxima (Fiji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
Efficienza 1 Placcatura = numero di colonie contate / numero di cellule placcato
2 frazione Sopravvivere = (numero di colonie contate / numero di cellule placcato) efficienza placcatura /
Tabella 1. Calcolo di efficienza placcatura e la sopravvivenza e il confronto di conta delle colonie utilizzando vari metodi
Figura 1. Immagine digitale che mostra prodotta da colonie umano, FEP-1811, cheratinociti dopo placcatura di 1000 cellule e otto giorni di incubazione. (A) Le cellule sono state irradiate con 4 Gy e (B), le cellule sono state trattate con 20 mg / ml CPF per 1 ora a 37 ° C prima di irraggiamento con 4 Gy. Un effetto protettivo radiazioni con la formulazione antiossidante naturale è evidente.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). HR è supportato da un australiano post-laurea e premi BakerIDI scintilla luminosa. Questo lavoro è finanziato dal CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), istituito e sostenuto nell'ambito del programma di ricerca cooperativa del governo australiano Centri. CO è il destinatario un australiano post-laurea e un premio CRC-BID borsa di studio integrativa.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
