Un método para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a través de retrovirus mediada por la expresión ectópica de Oct4, Sox2, Klf4 y MYC se describe. Una forma práctica para identificar las colonias de humanos IPSC basadas en la expresión de GFP también se discute.
Las células madre embrionarias (hESCs) son pluripotentes y una fuente inestimable para celulares en el modelado de la enfermedad in vitro y la medicina regenerativa 1. Se ha demostrado previamente que las células somáticas humanas pueden ser reprogramadas para pluripotencia por la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y Myc) y se convierten en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) 2-4. Al igual que hESCs, iPSCs humanos son pluripotentes y una fuente potencial de células autólogas. A continuación se describe el protocolo de reprogramar las células de fibroblastos humanos con los cuatro factores de reprogramación clonados en las buenas prácticas agrarias que contienen columna vertebral de retrovirales 4. Utilizando el protocolo siguiente, generamos iPSCs humanos en 3-4 semanas bajo condiciones de la cultura humana ESC. Humanos colonias IPSC se parecen mucho a hESCs en la morfología y mostrar la pérdida de la fluorescencia de GFP como resultado de silenciamiento de transgenes retrovirales. colonias aisladas IPSC mecánicamente bajo una fluorescencia microscópicaPE se comportan de una manera similar como hESCs. En estas células, se detecta la expresión de múltiples genes pluripotencia y marcadores de superficie.
Expresión de los cuatro factores de transcripción reprograma fibroblastos humanos a iPSCs. Muchos intentos se hicieron para generar iPSCs humanos utilizando los enfoques no integrar o no genéticos para generar iPSCs clínicamente seguros. Hasta ahora, estos métodos presentan una eficiencia extremadamente baja y requieren una mayor optimización para mejorar la reproducibilidad 11-14. Métodos de retro-o lentiviral son fácilmente utilizados para obtener y aplicar iPSCs para personas en modelos de…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Escuela de Medicina de Yale y el Premio de Investigación en Salud Infantil de la Fundación Charles Hood.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.