Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Summary

Un metodo per generare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) tramite retrovirus-mediata espressione ectopica di Oct4, Sox2, Klf4 e MYC è descritto. Un modo pratico per identificare umani IPSC colonie sulla base di GFP è anche discusso.

Abstract

Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono pluripotenti e una fonte inestimabile per cellulari in vitro modelli di malattia e della medicina rigenerativa ^1. E 'stato precedentemente dimostrato che cellule somatiche umane può essere riprogrammato per pluripotenza dall'espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e Myc) e diventare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ^2-4. Come hESC, iPSCs umani sono pluripotenti e una fonte potenziale di cellule autologhe. Qui descriviamo il protocollo per riprogrammare cellule di fibroblasti umani con i quattro fattori di riprogrammazione clonati in GFP-retrovirale contenente backbone ^4. Utilizzando il seguente protocollo, generiamo iPSCs umani in 3-4 settimane sotto condizione umana della cultura ESC. Umani colonie IPSC assomigliano hESC nella morfologia e visualizzare la perdita di fluorescenza GFP come risultato di silenziamento del transgene retrovirale. colonie IPSC isolato meccanicamente con un microsco fluorescenzape si comportano in modo simile a come hESC. In queste cellule, si rileva l'espressione di geni multipli pluripotenziali e marcatori di superficie.

Protocol

1. Riprogrammazione da Retrovirus Esprimere Fattori Riprogrammazione

1. Fibroblasti umani vengono coltivate in mezzo di fibroblasti (10% FBS in DMEM con Pen / Strep).
2. Un giorno prima dell'infezione, piastra 1x10 ⁵ fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
3. Aspirare il terreno per eliminare le cellule morte e aggiungere 2 ml di terreno di fibroblasti fresco. Aggiungere protammina solfato ad una concentrazione finale di 5 pg / ml.
4. Cautela aggiungere la quantità appropriata di ciascun GFP-esprime virus corrispondente ad una molteplicità di infezione (MOI) ⁵ 5.
5. Un giorno dopo l'infezione, rimuovere il supernatante virale, lavare tre volte con 2 ml di PBS, quindi aggiungere due medie fibroblasti ml.
6. Tre giorni dopo l'infezione, controllare la fluorescenza GFP e riempire il pozzo con 2 ml di terreno di fibroblasti.
7. Quattro giorni dopo l'infezione, la piastra 1x10 ⁴ / cm ² di fibroblasti embrionali di topo irradiati (MEF) in cellule di alimentazione di fibroblasti su un mezzo10-cm Petri rivestito con 0,1% di gelatina. Incubare a 37 ° C per una notte.
8. Cinque giorni dopo l'infezione, staccare infettati fibroblasti umani con 1 ml di 0,05% typsin / EDTA per 5 minuti a 37 ° C, e centrifugare per 5 minuti a 200 g. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo fibroblasti. Trasferire le cellule in un pre-rivestito 10-centimetri piastra.
9. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con il mezzo hESC cultura (20% Knock-Out sostituzione siero, DMEM/F12, 0,1 ml di aminoacidi non essenziali, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutammato, beta-merceptoethanol). Cambia il mezzo di tutti i giorni. ESC-colonie, come inizierà ad apparire di giorno 20-27 dopo l'infezione.

2. Isolamento ed espansione di iPSCs

1. Sotto un microscopio a fluorescenza, verificare l'assenza di fluorescenza GFP in una colonia che mostra una morfologia simile a hESC.
2. Usando una pipetta 10 pl, raccogliere le singole colonie IPSC e inserirli in un pozzetto di una gelatina e MEF-CoATed 12-pozzetti e integrato con media hESC. Cambiare media giornaliera.
3. Per passaging, lavare la piastra con 1 ml di DMEM/F12, quindi aggiungere 0,5 ml di collagenasi, e incubare per 10 minuti a 37 ° C.
4. Lavare le cellule due volte con DMEM/F12.
5. Aggiungere 2 ml di terreno fresco hESC. Utilizzando un sollevatore cella, rompere le colonie in piccoli pezzi e staccare le cellule rimanenti dalla piastra.
6. Trasferire i pezzi di colonie risospeso in un pozzetto di una gelatina e MEF rivestita piastra da 6 pozzetti.

3. Analisi Immunofluorescenza di marcatori pluripotenti

1. Lavare le cellule tre volte con PBS e fissare con 4% paraformaldeide per 20 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS e permeabile con 0,2% Triton X-100 in PBS per 30 min.
3. Blocco legame non specifico incubando le cellule con 3% BSA in PBS per due ore.
4. Incubare le cellule con anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
<li> Lavare le cellule tre volte con PBS e incubare le cellule con anticorpo secondario specifico per un'ora a temperatura ambiente, schermatura dalla luce.
5. Lavare le cellule tre volte con PBS e add DAPI durante l'ultimo lavaggio seguito da incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti.
6. Rilevare la colorazione con un microscopio a fluorescenza.

4. Quantitativa Real-time PCR per i marker pluripotenti

1. Isolare RNA totale dalle iPSCs umane derivate da fibroblasti umani usando il kit RNeasy Qiagen.
2. Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando trascrittasi inversa SuperScript II.
3. Eseguire qPCR per individuare i geni pluripotenziali usando i primer riportati in precedenza. ⁶

5. Risultati rappresentativi

1. Cambiamento morfologico durante la riprogrammazione
   Noi fibroblasti umani infettati BJ1 e Detroit 551 con un cocktail di retrovirus che trasportano Oct4, Sox2, Klf4 e MYC,e sono stati in grado di rilevare i cambiamenti morfologici durante riprogrammazione (Figura 1). Ventun giorni dopo l'infezione, riconosciamo piccole colonie IPSC dalla loro hESC-come morfologia. Inoltre, riconosciamo iPSCs dalla fluorescenza GFP. Le cellule staminali pluripotenti, come CES e iPSCs, esprimono il macchinario molecolare di reprimere l'espressione genica provirale ^7-9. Il nostro unico vettore retrovirale esprime GFP insieme riprogrammazione geni LTR retrovirale. Così, le cellule esprimenti GFP continuo sono considerati per esprimere transgeni senza silenziamento genico provirale. Fedelmente riprogrammati colonie IPSC che acquisiscono la rete pluripotenza molecolare dimostrare l'assenza di espressione di GFP (Figura 2) ^10.
   
2. Caratterizzazione della pluripotenza delle iPSCs umani
   Abbiamo analizzato le colonie derivate da Detroit-551 fibroblasti via immunoistochimica con Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSE-3, e gli anticorpi OCT4 Nanog ( (Figura 3A). Abbiamo anche analizzato espressione genica tramite RT-PCR quantitativa analisi. Abbiamo osservato che l'espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC e Nanog era significativamente maggiore rispetto alle cellule di fibroblasti dei genitori, ma commisurata a quella di hESC H9 (Figura 3B).

Figura 1. Cambiamenti morfologici di fibroblasti umani infettati da retrovirus. (AD) progressivo cambiamento morfologico nelle colonie da Detroit-551 fibroblasti infettati con i fattori di riprogrammazione. Giorno 5 (A), Giorno 10 (B), Giorno 14 (C), giorno 21 (D). Le cellule mostrano la hESC-come morfologia dopo 21 giorni.

Figura 2. Rappresentante espressione fluorescente GFP in cellule in fase di riprogrammazione. 4, e incubate in un mezzo hESC per quattro settimane. Fibroblasti BJ (A, B) e Detroit 551 (C, D) mostrano simili morfologica. Dal giorno 21, colonie GFP negativi cominciano a formarsi, che rappresentano le iPSCs buona fede ^10. (E, F) mostrano trasformato Detroit 551 cellule che non hanno subito corretta riprogrammazione. (A, C, E) colonie sotto vista a contrasto di fase. (B, D) correttamente riprogrammato cellule che mostrano il silenziamento GFP. (F) espressione GFP luminoso da colonia trasformata.

Figura 3. Caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane. (A) 551-umane iPS-K1 colonie di cellule esprimono marcatori comuni alle cellule pluripotenti. Colorazione DAPI indica il contenuto totale delle cellule per campo. (B) quantitativa real time-PCR (RT-qPCR) per l'espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC in f genitoriibroblast e 551-IPS-K1 iPSCs e H9 cellule staminali embrionali umane (hESC). I dati sono stati normalizzati contro la β-actina gene housekeeping e tracciati rispetto al livello di espressione nelle cellule di fibroblasti parentali ^4.

Discussion

Espressione di quattro fattori di trascrizione riprogramma i fibroblasti umani a iPSCs. Molti tentativi sono stati fatti per generare iPSCs umani utilizzando non-integrazione o non-genetica approcci per generare iPSCs clinicamente sicuro. Finora, questi metodi presentano efficienza estremamente bassa e richiedono ulteriore ottimizzazione per migliorare la riproducibilità ^11-14. Metodi Retro-o lentivirali sono facilmente utilizzati per ricavare e applicare iPSCs per l'uomo in modelli di malattia in vitro, che sono meno dipendenti dai problemi di sicurezza causati da integrazione virale. La riprogrammazione metodo qui descritto è disponibile per la derivazione efficiente di iPSCs umani. Selezione di iPSCs umani si basa principalmente sulla morfologia delle colonie che somiglia CSE umane. Ancora più importante, il nostro metodo sfrutta la caratteristica di far tacere delle ripetizioni retrovirali terminali lunghe (LTR) in cellule staminali pluripotenti ^7,15. Il vettore retrovirale utilizzato in questo protocollo contiene il gene GFP legato alla riprogrammazionefattori tramite una sequenza interna entrata ribosoma (IRES) e ^5. Espressione di GFP è guidato da LTR provirale. I fibroblasti infettati da questi virus inizialmente mostrano l'espressione luminosa GFP. Una volta completamente riprogrammato, iPSCs perderà espressione GFP, che è facilmente visualizzabile sotto un microscopio a fluorescenza. In questo protocollo, abbiamo descritto la generazione di iPSCs da fibroblasti fetali e neonatali (Detroit 551 e BJ1). Tuttavia, questo vettore retrovirale è stato utilizzato per generare iPSCs da fibroblasti normali adulti nonché una varietà di pazienti con disturbi mendeliani e complesse ^4,16,17.

In precedenza abbiamo analizzato il cambiamento di marcatori di superficie cellulare durante la riprogrammazione di cellule somatiche umane ^10. C'è un cambiamento progressivo marcatori di superficie cellulare. I fibroblasti esprimono CD13, che viene repressa mediante l'espressione di riprogrammazione. Le cellule in fase di avvio riprogrammazione di esprimere SSEA4 con GFP. Poi, perdono il espressivosulla via della GFP silecing provirale ed esprimere produttore ulteriore pluripotenza TRA1-60 ^10. L'espressione di TRA1-60 è ben correlata con silenziamento GFP e la ben sviluppata la formazione di teratoma, suggerendo che TRA1-60 è un marker per iPSCs fedelmente riprogrammate. GFP silenziamento è il marcatore alternativa per TRA1-60 espressione e permette l'identificazione delle colonie IPSC senza laboriosa colorazione cellule vive. Utilizzando la perdita di espressione GFP come marcatore per le iPSCs, cellule staminali gli scienziati che non hanno precedente esperienza nella riprogrammazione prontamente e costantemente isolare iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment