Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Summary

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Abstract

Menschliche embryonale Stammzellen (HES) sind pluripotent und einen unschätzbaren zellulären Quellen für In-vitro-Krankheit Modellierung und der regenerativen Medizin ^ein. Es wurde zuvor gezeigt, dass die somatischen Zellen Pluripotenz kann im Vergleich zur Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und Myc) umprogrammiert werden und werden induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) ^2-4. Wie hESCs, sind menschliche pluripotente IPSCs und eine potentielle Quelle für autologe Zellen. Hier beschreiben wir das Protokoll für die menschliche Fibroblasten-Zellen mit den vier Umprogrammierung Faktoren in GFP-haltigen retroviralen Backbone ⁴ geklont umzuprogrammieren. Mit dem folgenden Protokoll, erzeugen wir Menschen IPSCs in 3-4 Wochen unter die menschliche Kultur ESC Zustand. Menschliche iPSC Kolonien ähneln HES in der Morphologie und zeigt den Verlust der GFP-Fluoreszenz als Ergebnis von retroviralen Transgen-. iPSC Kolonien mechanisch unter einem Fluoreszenz-Mikroskopie isoliertEW verhalten sich ähnlich wie HES. In diesen Zellen erkennen wir die Expression mehrerer Gene und Pluripotenz Oberflächenmarker.

Protocol

1. Reprogrammierung von Retrovirus Reprogrammierungsfaktoren

1. Humane Fibroblasten in Fibroblasten-Medium (10% FBS in DMEM mit Pen / Strep) kultiviert.
2. Einen Tag vor der Infektion, Platte 1x10 ⁵ humane Fibroblasten in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
3. Saugen Sie Medium, um tote Zellen zu entfernen und 2 ml frisches Medium Fibroblasten. In Protaminsulfat in einer Endkonzentration von 5 pg / ml.
4. Vorsichtig die geeignete Menge jedes GFP-exprimierenden Virus entsprechend einer Multiplizität der Infektion (MOI) ⁵ 5.
5. Einen Tag nach der Infektion, entfernen Sie den Virus-Überstand, waschen, dreimal mit 2 ml PBS, dann 2 ml Fibroblasten-Medium.
6. Drei Tage nach der Infektion, überprüfen Sie die GFP-Fluoreszenz und füllt die gut mit 2 ml Fibroblasten-Medium.
7. Vier Tage nach der Infektion Platte 1x10 ⁴ / cm ² bestrahlt embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) Fibroblasten-Feeder-Zellen in Medium auf eine10-cm-Petrischale mit 0,1% Gelatine beschichtet. Bei 37 ° C über Nacht.
8. Fünf Tage nach der Infektion lösen infizierten menschlichen Fibroblasten mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° C, und für 5 Minuten bei 200 g. Saugen Sie das Medium, und Zellen mit 10 ml Fibroblasten-Medium. Übertragen der Zellen in eine Pre-beschichteten 10-cm-Platte.
9. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit hES-Kulturmedium (20% Knock-Out Serumersatz, DMEM/F12, 0,1 ml nicht-essentielle Aminosäuren, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol). Ändern Sie das Medium täglich. ESC-ähnliche Kolonien beginnt, am Tag 20-27 nach der Infektion auftreten.

2. Isolierung und Expansion von IPSCs

1. Unter einem Fluoreszenzmikroskop, das Fehlen der GFP-Fluoreszenz in einer Kolonie, die eine ähnliche Morphologie zeigt, HES zu überprüfen.
2. Mit einem 10 ul Pipette, Pick einzelnen iPSC Kolonien und legen Sie sie in eine Vertiefung einer Gelatine-und MEF-CoATed 12-Well-Platte und ergänzt mit hES-Medium. Ändern Medium täglich.
3. Für die Passage, waschen Sie die Platte mit 1 ml DMEM/F12, dann fügen Sie 0,5 ml Kollagenase, und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 ° C
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit DMEM/F12.
5. 2 ml frisches Medium hESC. Die Verwendung eines Handys Heber, brechen die Kolonien in kleine Stücke und lösen verbleibenden Zellen von der Platte.
6. Übertragen Sie die resuspendierten Stücke von Kolonien in eine Vertiefung einer Gelatine-und MEF-beschichteten 6-Well-Platte.

3. Immunfluoreszenz-Analyse von pluripotenten Marker

1. Die Zellen werden dreimal mit PBS und mit 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur.
2. Danach weitere Reinigung die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 30 min. Permeabilisieren
3. Sperren nicht-spezifische Bindung durch Inkubation von Zellen mit 3% BSA in PBS für zwei Stunden.
4. Inkubieren der Zellen mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C
<li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Inkubation der Zellen mit spezifischen sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur, Fernhalten von Licht.
5. Die Zellen werden dreimal mit PBS und merken DAPI beim letzten Spülgang durch Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Ermitteln Sie die Färbung mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

4. Quantitative Real-time PCR Assay für den pluripotenten Marker

1. Isolieren der Gesamt-RNA aus den menschlichen IPSCs aus humanen Fibroblasten mit Qiagen RNeasy-Kit abgeleitet.
2. Synthetisieren der Erststrang-cDNA unter Verwendung von SuperScript II Reverse Transkriptase.
3. Führen qPCR zu Pluripotenz-Gene unter Verwendung der Primer bereits berichtet erkennen. ⁶

5. Repräsentative Ergebnisse

1. Morphologische Veränderung während der Umprogrammierung
   Wir infizierten menschlichen Fibroblasten BJ1 und Detroit 551 mit einem Cocktail von Retroviren tragen Oct4, Sox2, Klf4 und MYC,und konnten morphologische Veränderungen während des Programmierens (1) zu erfassen. Einundzwanzig Tage nach der Infektion, erkennen wir kleine iPSC Kolonien durch ihre hES-ähnliche Morphologie. Darüber hinaus erkennen wir IPSCs durch die GFP-Fluoreszenz. Pluripotenten Stammzellen, wie WSR und IPSCs, drücken die molekulare Maschinerie zur Unterdrückung der proviralen Genexpression ^09.07. Unsere einzigartige retroviralen Vektors exprimiert GFP zusammen mit Umprogrammierung Gene durch retrovirale LTR. Somit werden Zellen, die GFP exprimieren kontinuierlich als Transgene ohne provirale Gen-Silencing auszudrücken. Getreu umprogrammiert iPSC Kolonien, die die Pluripotenz molekularen Netzwerk zu erwerben zeigen die Abwesenheit von GFP-Expression (Abbildung 2) ^10.
   
2. Charakterisierung von Pluripotenz menschlicher IPSCs
   Wir analysierten Kolonien von Detroit-551 Fibroblasten via Immunhistochemie abgeleitet mit TRA-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 und NANOG Antikörper ( (3A). Wir haben auch analysiert Genexpression über quantitative RT-PCR-Analyse. Wir haben beobachtet, dass die Expression von Oct4, Sox2, Klf4, MYC und NANOG signifikant war im Vergleich zu den parentalen Fibroblasten-Zellen erhöht, aber angemessen mit der H9 hESCs (3B).

Abbildung 1. Morphologischen Veränderungen der Retrovirus-infizierten menschlichen Fibroblasten. (AD) Progressive morphologische Veränderung in Kolonien von Detroit-551 Fibroblasten mit Umprogrammierung Faktoren infiziert. Tag 5 (A), Tag 10 (B), Tag 14 (C), Tag 21 (D). Die Zellen zeigen den hES-ähnliche Morphologie nach 21 Tagen.

Abbildung 2. Vertreter fluoreszierende GFP-Expression in Zellen, die eine Neuprogrammierung. 4 infiziert und inkubiert in hES-Medium für vier Wochen. BJ-Fibroblasten (A, B) und Detroit 551 (C, D) zeigen ähnliche morphologische. Vom ersten Tag 21, beginnen GFP-negative Kolonien zu bilden, aus denen die bona fide IPSCs ^10. (E, F) zeigen, verwandelt Detroit 551 Zellen, die nicht ordnungsgemäße Umprogrammierung unterzogen wurden. (A, C, E) Kolonien unter Phasenkontrast-Ansicht. (B, D) richtig Zellen, die das GFP-Silencing zeigen umprogrammiert. (F) helle GFP-Expression von transformierten Kolonie.

Abbildung 3. Die Charakterisierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen. (A) Menschliche iPS-551-K1 Zellkolonien auszudrücken Marker gemeinsam pluripotenten Zellen. DAPI-Färbung zeigt die gesamte Zellgehalt pro Feld. (B) Quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) für die Expression von Oct4, Sox2, Klf4, MYC im elterlichen fibroblast, 551-iPS-K1 IPSCs, H9 und humanen embryonalen Stammzellen (hES). Die Daten wurden gegen β-Actin Housekeeping-Gen normalisiert und aufgetragen relativ zu der Expression in den parentalen Zellen ⁴ Fibroblasten.

Discussion

Die Expression von vier Transkriptionsfaktoren umprogrammiert menschlichen Fibroblasten zu IPSCs. Viele Versuche wurden unternommen, um Menschen mit IPSCs nicht integrierenden oder nicht-genetische Ansätze zu einer klinisch sicheren IPSCs generieren generieren. Bisher zeigen diese Methoden extrem niedrigen Wirkungsgrad und erfordern eine weitere Optimierung, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern ^14.11. Retro-oder lentiviralen Methoden werden verwendet, um ohne weiteres abzuleiten und anzuwenden IPSCs für den menschlichen In-vitro-Krankheit Modelle, die weniger abhängig von den Fragen der Sicherheit durch virale Integration verursacht werden. Reprogrammierung hier beschriebene Methode ist für die effiziente Gewinnung menschlicher IPSCs. Auswahl des menschlichen IPSCs basiert vor allem auf die menschliche Koloniemorphologie WSR ähnelt basiert. Noch wichtiger ist, führt unsere Methode den Vorteil dieser Funktion von Silencing der retroviralen langen terminalen Wiederholungen (LTR) in pluripotenten Stammzellen ^7,15. Der retrovirale Vektor in diesem Protokoll verwendet wird, enthält das GFP-Gen im Zusammenhang mit der UmprogrammierungFaktoren über einen internen Ribosomeintrittssequenz (IRES) und ^5. GFP-Expression wird durch proviralen LTR angetrieben. Die Fibroblasten mit diesen Viren infiziert zunächst zeigen das helle GFP-Expression. Sobald sie vollständig neu programmiert, wird IPSCs verlieren GFP-Expression, die leicht visualisiert werden unter einem Fluoreszenzmikroskop ist. In diesem Protokoll beschrieben wir die Generation der IPSCs von fetalen und neonatalen Fibroblasten (Detroit 551 und BJ1). Allerdings hat diese retroviralen Vektor verwendet worden, um IPSCs von normalen adulten Fibroblasten sowie eine Vielzahl von Patienten mit Mendelschen und Komplexerkrankungen ^4,16,17 erzeugen.

Bisher haben wir die Veränderung der zellulären Oberflächenmarker während der menschlichen Körperzelle Umprogrammierung ¹⁰ analysiert. Es ist eine schrittweise Veränderung Zelloberflächenmarker. Fibroblasten ausdrückliche CD13, die durch die Expression der Anpassung reprimiert wird. Zellen, die eine Neuprogrammierung Start in SSEA4 auszudrücken zusammen mit GFP. Dann verlieren sie die expressiauf der GFP über provirale silecing und Express zusätzliche Pluripotenz maker TRA1-60 ^10. Die Expression von TRA1-60 ist mit GFP-Silencing und das gut ausgebaute Teratombildung korreliert, was darauf hindeutet, dass TRA1-60 ein Marker für treu umprogrammiert IPSCs ist. GFP-Silencing ist die Alternative Marker für TRA1-60 Ausdruck und ermöglicht die Identifikation von iPSC Kolonien ohne aufwändige Live-Cell-Färbung. Mit dem Verlust der GFP-Expression als Marker für IPSCs, Stammzellen-Wissenschaftler, die keine vorherige Erfahrung in Reprogrammierung wird leicht und konsequent zu isolieren IPSCs haben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment