وهناك طريقة لتوليد الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها الخلايا (iPSCs) عبر الارتجاعي بوساطة التعبير خارج الرحم من OCT4، يوصف SOX2، KLF4 وMYC. ويناقش أيضا وسيلة عملية لتحديد المستعمرات iPSC الإنسان على أساس التعبير GFP.
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) متعددة الإمكانات ومصادر لا تقدر بثمن للخلوي في النمذجة مرض المختبر، والتجدد الطب 1. ولقد ثبت من قبل أنه يمكن إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية إلى تعدد القدرات بواسطة التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ الأربع (Oct4، Sox2، Klf4 وMyc)، وأصبح بفعل الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) 2-4. مثل hESCs، iPSCs الإنسان هي المحفزة ومصدرا محتملا للخلايا ذاتي. نحن هنا وصف بروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع العوامل الأربعة المستنسخة إلى إعادة برمجة GFP المحتوية على العمود الفقري فيروسات 4. باستخدام بروتوكول التالية، ونحن توليد iPSCs الإنسان في 3-4 أسابيع تحت حالة الإنسان ثقافة ESC. الإنسان المستعمرات iPSC تشبه hESCs في التشكل وعرض الخسائر في مضان GFP نتيجة لإسكات التحوير فيروسات. المستعمرات iPSC معزولة ميكانيكيا تحت microsco مضانPE تتصرف بطريقة مشابهة كما hESCs. في هذه الخلايا، ونحن للكشف عن التعبير عن الجينات متعددة تعدد القدرات وعلامات سطح.
التعبير عن الخلايا الليفية النسخ 4 يعيد البرمجة العوامل البشرية إلى iPSCs. جرت محاولات عديدة لتوليد iPSCs الإنسان باستخدام أساليب غير دمج أو غير الجينية لتوليد iPSCs الآمنة سريريا. حتى الآن، هذه الأساليب تظهر كفاءة منخفضة للغاية وتتطلب التحسين إضافية لتحسين استنساخ 11-14.</…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية الطب بجامعة ييل، وجائزة الطفل بحوث الصحية من مؤسسة تشارلز هود.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.