En fremgangsmåde til at generere humane inducerede pluripotente stamceller (IPSC'er) via retrovirus-medieret ektopisk ekspression af OCT4 er SOX2, KLF4 og MYC beskrevet. En praktisk måde at identificere menneskelige IPSC kolonier baseret på GFP-ekspression er også diskuteret.
Humane embryonale stamceller (hESCs) er pluripotente og en uvurderlig cellulære kilder til in vitro sygdom modellering og regenerativ medicin 1. Det er tidligere blevet vist, at humane somatiske celler kan omprogrammeres til pluripotens ved ektopisk ekspression af fire transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og Myc) og blive induceret pluripotente stamceller (IPSC'er) 2-4. Ligesom hESCs, er menneskelige IPSC'er pluripotente og en potentiel kilde til autologe celler. Her beskriver vi den protokol, at omprogrammere humane fibroblastceller med de fire omprogrammeringsbeslutninger faktorer klonet i GFP-holdige retroviral rygraden 4. Brug følgende protokol, vi skaber menneskelige IPSC'er i 3-4 uger under menneskelige ESC kultur tilstand. Humane IPSC kolonier ligner hESCs i morfologi og viser tab af GFP-fluorescens som følge af retroviral transgen lyddæmpning. IPSC kolonier isoleres mekanisk under en fluorescens microscoPE opføre sig på samme måde som hESCs. I disse celler, detektere vi ekspressionen af multiple pluripotens gener og overflademarkører.
Ekspression af fire transkriptionsfaktorer omprogrammerer humane fibroblaster til IPSC'er. Mange forsøg på at generere humane IPSC'er med ikke-integrerende eller ikke-genetiske fremgangsmåder til at generere klinisk sikre IPSC'er. Hidtil har disse metoder udviser ekstremt lave effektivitet og kræver yderligere optimering for at forbedre reproducerbarheden 11-14. Retro-eller lentiviral metoder let bruges til at udlede og anvende IPSC'er til human in vitro sygdomsmodeller, …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret ved Yale School of Medicine and Child Health Research Award fra Charles Hood Foundation.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.