Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Summary

En metod för att generera humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) via retrovirus-medierad ektopiskt uttryck av Oct4 är SOX2, KLF4 och MYC beskrivits. Ett praktiskt sätt att identifiera de mänskliga IPSC kolonier som bygger på GFP-uttryck diskuteras också.

Abstract

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) är pluripotenta och en ovärderlig cellulära källorna för in vitro sjukdomar modellering och regenerativ medicin ^1. Det har tidigare visat att humana somatiska celler kan omprogrammeras för att pluripotens med ektopisk uttryck av fyra transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 och Myc) och bli inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) ^2-4. Liksom hESCs, humana iPSCs är pluripotenta och en potentiell källa för autologa celler. Här beskriver vi protokollet att programmera humana fibroblastceller med de fyra omprogrammeringar faktorer klonade in i GFP som innehåller retrovirala ryggraden ^4. Med hjälp av följande protokoll, genererar vi människor iPSCs i 3-4 veckor under mänsklig ESC kulturen villkor. Humana IPSC kolonier liknar nära hESCs i morfologi och visa en förlust av GFP-fluorescens som ett resultat av retroviralt transgen tystande. IPSC kolonier isolerades mekaniskt under en fluorescens microscope uppträda på ett liknande sätt som hESCs. I dessa celler detektera vi uttrycket av multipla pluripotensbestämmande gener och markörer på ytan.

Protocol

1. Omprogrammering av retrovirus som uttrycker omprogrammeringar Faktorer Humana fibroblaster odlas i fibroblast-medium (10% FBS i DMEM med Pen / Strep). En dag före infektion, plattor 1×10 '5 humana fibroblaster i en brunn av en 6-brunnsplatta. Aspirera medium för att avlägsna döda celler och tillsätt 2 ml av färskt fibroblast medium. Tillsätt protaminsulfat vid en slutlig koncentration av 5 pg / ml. Tillsätt försiktigt den lämpliga mängden av varje GFP…

Discussion

Expression av fyra transkriptionsfaktorer omprogrammerar humana fibroblaster till iPSCs. Många försök gjordes för att generera humana iPSCs med användning av icke-integrerande eller icke-genetiska metoder för att generera kliniskt säkert iPSCs. Hittills har dessa metoder uppvisar extremt låg verkningsgrad och kräver ytterligare optimeras för att förbättra reproducerbarheten ^11-14. Retro-eller lentiviral metoder lätt används för att härleda och tillämpa iPSCs för in vitro på männis…

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.