3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

Summary

ここでは、文化、人間の神経前駆細胞への自己組織化3次元足場の使用を説明します。我々は、フローサイトメトリーで、その後、例えば、分析する足場から細胞を解放するためにプロトコルを提示する。このプロトコルは、詳細な機構的な研究を行うために他の細胞型に適応される可能性があります。

Abstract

成長、増殖、最終的に神経分化の3次元（3D）足場の影響は、神経疾患や神経変性疾患におけるセルベースおよび標準化された治療のための新しい方法を見つけるために非常に興味深いです。 3次元構造は、2Dの文化よりも生体状況のためにはるかに近い環境を提供することが期待されています。再生医療の文脈では、神経幹細胞および前駆細胞を用いた生体材料の足場の組み合わせは、治療ツールとして大きな可能性を秘めています。三次元環境をエミュレートする^1月5日培養のシステムは、ステムの異なる種類の増殖と分化に影響を及ぼすことが示されていると前駆細胞。ここで、3D - microenviromentの形成と官能化が埋め込 ​​まれた細胞の生存と運命を決定することが重要である^。6-8ここでは、PuraMatrix ^{9,10（RADA16、PM）、}ペプチドベースのハイドロゲル足場を、使用うまく説明すると、異なる種類の細胞上で3次元環境の影響を研究するために使用されている^。7,11-14 PuraMatrixは簡単にカスタマイズし、ナノファイバーの合成加工は、その高い信頼性の3次元培養システムを、提供することができますさらに外国人のフリーになります。

最近では、足場の形成にPM -濃度の影響を検討してきた。本研究では¹³ PMの使用濃度は、原子間力顕微鏡によって実証された3次元構造の形成に直接影響を持っていた。 hNPCsの生存と分化のその後の分析では、埋め込まれた細胞の運命でPMの使用濃度の影響を明らかにした。しかし、免疫蛍光技術の保有いくつかのハードルによる生存や神経分化の解析。信頼性の高いデータを得るために、一例の相対的な数を取得するには、マトリックス内のセルの合計数を決定する必要があります。 βIII-チューブリンでマークされた神経細胞。この前提条件が試料のz -スタックを取ることができる蛍光顕微鏡のような共焦点顕微鏡または同等の技術によってすべての3次元の足場を分析する手法。さらに、この種の分析は非常に時間がかかります。

ここでは、フローサイトメトリーにより、後で分析などのために3D -足場から細胞を解放する方法を示しています。このプロトコルではReNcell VM細胞株のヒト神経前駆細胞は、（hNPCs）（ミリポア米国）ラミニン（PML）を添加したPuraMatrix（PM）またはPuraMatrixから成る3次元足場で培養して分化させた。私たちの手で0.25％のPM -濃度はセル¹³の栽培に最適である、しかし濃度が他の細胞タイプに適応される可能性があります^。12リリースの細胞は、例えば免疫組織化学的研究に使用し、その後フローサイトメトリーによって分析することができます。分析とMOが高速化データの信頼性を向上、より広い基盤に基づい、得られたデータの残りを上に再。

Protocol

1。パート1：PuraMatrixのhNPCsの文化

1. ラミニンなしで0.25％のPuraMatrix濃度と足場の世代に、事前に以下の溶液を調製する必要があります。
2. 20％ショ糖と滅菌蒸留水に溶解した10％ショ糖を含む溶液を含む溶液を準備します。
3. 1.5ミリリットルコニカルチューブに蒸留水120μlの20％ショ糖溶液の溶液1ミックス120μlのために。
4. 1.5ミリリットルコニカルチューブに20％ショ糖溶液60μlのあるPuraMatrix液の溶液2ミックス60μlのために。

以下の溶液を調製するラミニン（100μlのマトリックスごとに8μgの）1つのニーズを補充した0.25％のPuraMatrix濃度と足場の調製のための。

1. 20％ショ糖溶液を120μlのと1.5 mlのコニカルチューブに48μlのラミニンと蒸留水の溶液1を混合72μLのため。
2. 1.5ミリリットルコニカルチューブに20％ショ糖溶液60μlの溶液2を混合60μlのPuraMatrixソリューションのため。

5. PuraMatrixの細胞の埋め込みのために4ウェル細胞培養プレートを用意し、2つのウェルで滅菌ガラス製カバースリップ（直径13ミリメートル）を置きます。後で使用するために、クリーンベンチ内でプレートを保管してください。ガラスカバースリップは、免疫細胞化学的研究に使用されます。ない免疫細胞化学的stainingsが意図されていない場合、このステップは省略することができます。

3Dスキャフォールドのいずれかのカプセル化のためにhNPCsを準備するには、以下の溶液を調製する必要があります。 1:10.000の希釈率を使用して、トリプシン/ EDTA溶液中でのベンゾナーゼを希釈する。 Trypsin-Inhibitor/Benzonaseソリューションミックス：DMEM/F12 +ベンゾナーゼ25U/μl+ 1％HSA +トリプシン阻害剤（0.5mg/ml）。

6. インキュベーター中で5分間（37℃、5％CO _2）のために500μlのトリプシン/ベンゾナーゼソリューションとインキュベートを追加することによって細胞を剥離する。 Trypsin-Inhibitor/Benzonaseの溶液との反応を停止します。その後、3000 x gで5分間剥がれた細胞を遠心分離再び5 mlの10％ショ糖溶液と遠心で細胞を洗浄する。上清を捨てる。
7. 10％のショ糖溶液で細胞を再懸濁し、最終的に細胞溶液は、1 × 10 ⁶細胞/ ml含まれている必要があります。

次のステップ、1.8〜1.11、のための細胞に有害であるかもしれないPuraMatrixソリューション、の低pHから、可能な限り高速に実行する必要があります。

8. ソリューション1の細胞懸濁液の60μlを混合します。
9. 解決策2をコニカルチューブに、細胞を含む、溶液1の120μlを加え、慎重に混ぜる。
10. 各カバーの直後に混合物の代わりに100μlの4 - wellプレートに住んでスリップ。
11. よく、別の200μlの2〜3分後ごとに徐々に200μlの細胞培養培地を追加。これは行列の自己組織化を開始します。
12. インキュベートC37 ells ° C、加熱プレートまたは、クリーンベンチの加熱領域でクリーンベンチ内で1時間のため。これは行列の組み立てに危害を加える可能性があるとして、可能な限り板を移動しないでください。
13. 培地のほとんどを除去しますが、すべてではない、1000μlのピペットで、乾燥した下降行列を避けるために。 10分の行列を洗浄する培地500μlを添加します。最後に、培地を除去し、500μlの新鮮培地を追加し、インキュベーター（37℃、5％CO _2）の培養プレートを置きます。行列がプレートを衝撃に敏感であるため、可能であれば、別のインキュベーターでは、、可能な限り少ないように移動し、格納する必要があります。
14. ここで使用されるhNPCsは、3D -足場と分化に7日間増殖された増殖因子¹³の撤退によって開始された。培地は2〜3日おきに交換した。

2。第2部：行列全体の免疫細胞化学染色

1. 染色手順の前日は準備する必要があります。AB5％正常ヤギ血清とトリトンX - 100 PBS、0.1 M PBSに基づいて4％パラホルムアルデヒド溶液に溶解し、4とソリューション'、6 - Diamidin - 2'- phenylindoldihydrochloridを必要に応じて（の0.3％から成るロック緩衝溶液PBSに溶解した100ngのDAPI / mlを含有する核染色のためのDAPI）。サンプルはMowiol及びDABCOの混合物でマウントされた。
2. 行列は、1000μlのピペットで培地を除去し、5分間PBSで1回足場を洗う洗浄する。
3. 足場を修正するにはPBSを除去し、各ウェルにパラホルムアルデヒド400μlの（0.1 M PBS中4％）を追加し、室温で30分間の行列をインキュベートする。固定足場は数ヶ月〜数週間までに0.02％4でのNaN ₃ ° Cを添加したPBS中で保存することができます。
4. 染色の前に5分間PBSで足場を洗う。
5. 緩衝溶液をブロッキングに足場をインキュベートする。ブロッキング溶液は3回2〜3時間おきとsubsequを変更されましたently足場は4℃で一晩ブロッキング溶液でインキュベートした。℃で
6. ブロッキング緩衝溶液を除去し、1％正常ヤギ血清を添加したPBSに溶解した一次抗体を追加し、4℃で一晩行列をインキュベート℃に
7. 一次抗体溶液を除去し、洗浄は4で一晩4 2時間の時間とその後の足場° CをPBSで。
8. PBSを除去し、PBSに溶解した二次抗体とソリューションを、追加するには、暗所で室温で4時間、1％正常ヤギ血清を補充した。
9. 4℃一晩1時間、その後℃の暗所でのPBS 4-6回でサンプルを洗浄してください。
10. 核染色用のものは30分間のDAPI溶液400μlを追加することができます。
11. いずれかの顕微鏡スライドを必要とするサンプルをマウントする。顕微鏡スライド上に50μlのMowiol / DABCOを追加。 4ウェルプレートからカバーガラスを取り外し、取り付け媒体上に慎重にそれらを置く。
12. ここでは、Biozero 8000使用単一の顕微鏡写真とz -スタックを取得するために顕微鏡（キーエンス、ドイツ、カールスルーエ）。各スタックは1〜2μmの距離を30つの画像が含まれています。 Z -スタックの完全な予測が生産される前に対応するアナライザソフトウェアを使用して蛍光に固有のぼかしが削除されました。

3。パート3：フローサイトメトリー解析のための足場からhNPCsのリリース

1. 足場からの細胞の放出に事前に500μlのHBSSで足場が洗う。
2. 細胞培養培地を含む15 mlのコニカルチューブに1000μlのピペットを用いて足場を移す。
3. 足場を混乱させるためには機械的に1000μlのピペットで細胞溶液を数回再懸濁し、続いて5分、3000 × gで解決策を遠心する。
4. ピペットで上清を除去、トリプシン/ベンゾナーゼ溶液500μlを追加し、細胞ペレットを数回懸濁します。
5. 5分間細胞をインキュベート37℃でトリプシン/ベンゾナーゼソリューションのC。反応は、1mlのTrypsin-inhibitor/Benzonaseのソリューションを追加し、上下に数回ピペッティングして停止する。
6. 細胞懸濁液を3000 × gで5分間遠心し、上清を除去し、2mlのHBSS緩衝液で細胞を洗浄する。このステップを2回繰り返します。この手順では、行列の残骸を削除します。
7. 細胞懸濁液の谷の凝集物を除去し、細胞培養培地で細胞を回収するために、セルストレーナー（孔径70μm）を渡します。得られた細胞をパッチクランプやfluometric測定などの機能研究のためにカバースリップ上に、例えば再播種することができます。フローサイトメトリー用細胞を処理するには、（4.1参照）、すぐに細胞を固定する。

4。パート4：フローサイトメトリーによるβIII-チューブリン陽性細胞の定量化

1. 室温で15分間、1％PFAでステップ3.7で得られた放出細胞を固定する。
2. 3000 XGとリムーバブルで5分間、細胞懸濁液を遠心電子清。必要に応じて、細胞は° C、後で解析するために4℃で保存することに調製することができる。したがって、（PBS、0.5％BSAおよび0.02％ナトリウムアジドを添加した）洗浄バッファーで細胞を再懸濁します。
3. フローサイトメトリーのための準備を続行するには、350 × gで10分間細胞懸濁液を遠心、上清を廃棄し、抗体溶液の25μlの細胞を再懸濁します。したがって、最初の抗体は、濃度1:100などβIII-チューブリンでサポニン緩衝液と混合される。サポニンバッファは、0.5％のサポニン濃度、0.5％のBSAの濃度と0.02％のNa -アジド濃度でPBSで構成されています。
4. シェーカー上で室温で2時間一次抗体と細胞懸濁液をインキュベートする。ネガティブコントロールとして、第一の抗体なしのサンプルを準備する。
5. 最初の洗浄ステップでは細胞に直接300μlのサポニンのバッファを追加します。 350 × gで5分間、細胞懸濁液を遠心第二洗浄工程のため、廃棄上清を、300μlのバッファーを追加し、350 × gで5分間、細胞懸濁液を遠心分離
6. 上清を除去し、二次抗体（例えばのAlexa Fluor 647、1:1000、サポニンバッファに溶解）を含む25μlの溶液を添加する。暗所で室温で二次抗体を1時間、細胞をインキュベートする。
7. 最初の洗浄ステップでは細胞に直接300μlのサポニンのバッファを追加します。 350 × gで5分間、細胞懸濁液を遠心第二洗浄工程については、上清を捨てて300μlのバッファーを追加し、350 × gで5分間、細胞懸濁液を遠心分離
8. 上清を捨て、フローサイトメトリー分析のための500μlの洗浄緩衝液で細胞を再懸濁します。

5。代表的な結果

自己組織化ヒドロゲル足場PuraMatrixで培養hNPCsの例を図1に示されています。 hNPCsは変更されていないPMの構造のような球状に成長する。この培養条件で球の間のプロセスの束が（図1A）表示されているもののの、細胞はほとんど、透過光で認識することはできません。使用される細胞型の培養条件に応じて、マトリックスはラミニンを追加することにより、例えば、変更することができます。 hNPC細胞ラインReNcell VM（ミリポア）ラミニンのために密度の低い凝集体が、細胞（図1B）によって、より均一な分布と成長パターンを誘導することが必要です。変更の独立した、マトリックスは、例えば神経分化を研究するために使用することができます。図1Cは、神経マーカーであるβIII-チューブリンのためのhNPCsの染色を示す。この例では細胞は、マトリックスで7日間増殖させ、その後、分化、増殖因子EGFおよびbFGFの撤退により誘導された4日間、分化さ¹³細胞体と細胞によって構築されたプロセスの密なネットワークがすることができます容易に認識。しかし、それは細胞数の定量化は、多数のように、時間がかかることは明らかであるマトリックスの様々な地域の写真は、統計分析のための信頼性の高いデータ基盤を得るために、分析する必要があります。イチジクの1Dで1つはマトリックスから放出され、その後カバースリップ上でplatted細胞の例を見ることができます。これらの細胞は、機能解析などに使用される可能性があります。

3D -足場からの細胞の放出は、マーカータンパク質またはAnnexinV / PI染色やTUNELアッセイにより細胞の生存率の式のように異なるパラメータを分析する可能性を提供しています。図2は、βIII-チューブリン⁺細胞の割合のフローサイトメトリー分析の例を示しています。ネガティブコントロールは、（細胞がβIII-チューブリンのマークが付いていない）図2Aに示されています。これらのコントロールは、βIII-チューブリン⁺細胞の後の検出（図2B）のためのゲートを決定するために使用されます。細胞の手動カウントとフローサイトメトリーによる分析の比較を図2Cに示されています。 βIII-チューブリン⁺細胞の割合は、determいた総細胞数（核をDAPI染色による）と蛍光画像でβIII-チューブリン⁺細胞の数を数えることによってined。

図1。自己組織化ペプチドハイドロゲルPuraMatrixで培養した。）hNPCs PuraMatrixにカプセル化されたhNPCsは （PM）球の直径は最大で数百μmにすることができる球状の、密なパックされた構造に成長する。球の間では、1つは、細胞（矢印）で構築されたプロセスのバンドルを認識することができます。 B）ラミニンを添加したPuraMatrixにカプセル化された細胞は、（PML）、より均一に分散、少ない密な構造に成長する。行列つを補足したラミニンに密度の低い領域（矢印）で、単一の細胞を認識することができます、しかしそれは、細胞数を定量化するためにほとんど不可能です。 C）hNPCsは、βIII-チューブリン（緑）のようなPML発現する神経細胞のマーカーで4日間分化。 evaluaへTE一DAPI（青）のような核染色により細胞数を決定するために持っている陽性細胞の割合。顕微鏡写真は、Biozero - 8000顕微鏡で撮影した画像のz -スタックの完全な投影を示す。 D）マトリックスから放出された細胞は、さらに機能的な研究のために、例えばカバースリップ上に播種することができます。顕微鏡写真は、リリース手順に続いて、3次元培養した細胞を示しています。 βIII-チューブリン（赤）のための染色は、3次元足場でホストされている細胞と同等の形態を明らかにする。

図2。 PuraMatrixから放出されるフローサイトメトリー分析細胞。顕微鏡の時間のかかる定量化を克服するために我々は、フローサイトメトリーによる高速な分析へのアクセスを与えるPuraMatrixで培養した細胞を解放するためにプロトコルを使用していました。 A）未染色細胞は、その後の分析のためのゲート（黒フレーム）を設定するために、ネガティブコントロールとして使用した例えば、βIII-チューブリンの細胞の。 B）ネガティブコントロールで設定した同じゲートは、、使用されたβIII-チューブリン⁺細胞の割合を定量化する。陽性細胞は、中間の人口が最も可能性の高い細胞の破片を表す、（点線枠）が観察されたまた、x軸、の右側部分に表示されます。 C）、フローサイトメトリーによってカウントマニュアル計数した細胞と細胞との比較は、βIII-チューブリンの数の時間依存性は^、+フローサイトメトリーのプロトコルの信頼性を示す、匹敵した陽性細胞のはるかに高い割合を、明らかにした。

Discussion

3D -足場の使用は、 生体状況に近い細胞培養の状況で異なる細胞型の開発を研究する機会を提供しています。しかし、例えば、神経分化または1が細胞型の例：定量化のための信頼性の高いデータを得るためにいくつかの障害を克服しなければならない機能的研究の分析に関する。

ここでは、足場PuraMatrixとFACSまたは機能アッセイなどのツールへの容易なアクセスを提供する2D状況の研究に使用される細胞のその後のリリースに基づいてペプチドハイドロゲルでhNPCsの文化を説明した。最近我々は原子間力顕微鏡と細胞の生存や分化への影響による3次元スキャフォールドの形成にPuraMatrix濃度の影響を示した^。13しかし、人はそれぞれのセルのタイプは異なる文化を必要とするかもしれないことに留意することがある他の材料で構成される条件や行列はmatrigを例えばエルまたはコラーゲン。

細胞を解放するプロトコルは、製造業者¹⁸によって提供されるプロトコルに基づいており、細胞の機械的な分離が酵素による物質の周囲の消化が続いているなどの主要なニューロン培養を準備するために使用されるプロトコルと同等です。細胞は、この手順を許容し、重要とプロセスを構築滞在し、いったんはラミニンコーティングされた表面に再び播種され、βIII-チューブリンのような神経マーカーを発現する。ここでは、βIII-チューブリン⁺細胞の量を定量化するためにリリースされた細胞をフローサイトメトリーの研究を行った。顕微鏡で細胞を計数することにより、"手動で"行う定量との比較では、βIII-チューブリン⁺細胞のはるかに高い割合を明らかにした。これは、多くの場合、手動解析（プローブあたり数百）に比べてフローサイトメーター（プローブあたり50.000）で計数した細胞数の増加によるものです。しかし、＆bの数の動態η、III -チューブリン⁺細胞は我々が時間をかけてβIII-チューブリン⁺細胞の減少を検出する両方のサンプルで同じパターンに従います。これはReNcell VMの細胞を用いた研究に準拠しています。マニュアル分析中に克服するために^15〜17その他のハードルはほとんど解析されないことができる行列や"本物"の過小評価結果マトリックス材料の高バックグラウンドの非常に密度の高い領域であるセル番号。我々は、このプロトコルが増殖、分化や細胞の生存率のいくつかの側面を定量化するために高速で信頼性の高い方法を提供する他の細胞型に適合させることができると確信しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PuraMatrix peptide hydrogel	BD Biosciences	354250
Mouse laminin I	Cultrex	400-2009090
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Normal goat serum	Dako	X0907
Triton X 100	Carl Roth Gmbh	3051.3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14170-088	Hanks’ Balanced Salt Solution 1X
βIII-tubulin antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-51670	Mouse, monoclonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Goat α mouse, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Goat α mouse, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98%
Cell strainer	BD Biosciences	352350	70 μm pore size
Saponin	Merck & Co., Inc.	7695
Trypsin/ EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
Benzonase 250 U/μl	Merck & Co., Inc.	1.01654.0001
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Human-Albumin Kabi 20%