Summary
Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode for å isolere og forsterke genomet av single virons. Virale suspensjoner av en blandet samling sorteres ved hjelp av flow cytometri på et objektglass med diskrete brønner inneholdende agarose, for derved å fange virion og redusere genomet klipping under nedstrøms bearbeiding. Hele genomet forsterkning oppnås ved bruk av multippel forskyvning forsterkning (MDA) som resulterer i genomisk materiale som er egnet for sekvensering.
Abstract
Hele genomet forsterkning og sekvensering av single mikrobielle celler gjør genomisk karakterisering uten behov for dyrking 1-3. Virus, som er allestedsnærværende og de mest tallrike enheter på planeten vår 4 og viktig i alle miljøer 5, har ennå ikke avslørt via lignende tilnærminger. Her beskriver vi en tilnærming for å isolere og karakterisere de genomer av single virions kalt "enkelt virus Genomics '(SVG). SVG benytter strømningscytometri for å isolere individuelle virus og hele genomet forsterkning for å oppnå høy molekylvekt genomisk DNA (gDNA) som kan anvendes i de følgende reaksjoner sekvensering.
Protocol
En. Utarbeidelse av Viral utestengelse
Før isolering av enslige virions via flowcytometri, forberede ufestede viral suspensjoner.
- Isolere virale partikler ved hjelp av tidligere etablerte protokoller som gjør sikker endelige virale suspensjon er inneholdt i 0,1 um-filtrert TE (Tris-EDTA, pH 8). Vi anbefaler å bruke tangentialfiltrering filtrering (TFF) nærmer seg seks selv om andre metoder har blitt utviklet som bruker kjemisk flokkulering 7.
- Nummerere viruspartikler ved hjelp av etablerte protokoller, for eksempel ved hjelp epifluorescence 8-10 eller flowcytometri 11,12.
- Delmengde viral suspensjon i to Eppendorf-rør (endelig volum anbefales for å være 1,000 ul).
2. Flowcytometrisystemer
- Hvis du vil sortere virus ved hjelp av BD FACSAria II Flowcytometer utstyrt med en tilpasset Forward Scatter PMT (FSC PMT) fortynnes viruspartikler i 0,1 mikrometer-filtrert TE, 8 pH.0 til en passende titer for en hendelse hastighet på 200 sek -1 hendelser.
- Sett terskler for å maksimere signal-til-støy-rasjoner, f.eks. for en blandet samling som inneholder T4 og lambda fag-partikler følgende anbefales: FSC PMT på 1000 og SSC 200.
- Kjør 100 ul av "blanke" prøver som inneholder bare ett) 0,1 mikrometer-filtrert TE og 2) 0,1 mikrometer-filtrert TE og SybrGreen1 på 1e-4 fortynning på lager (10.000 X).
- Kjør en liten alikvot (100 pl anbefales) av unstained viral suspensjon for å vurdere bakgrunn, etterfulgt av farget viral suspensjon (SybrGreen1 på 1E-4 fortynning av lager), virale partikler til en total på 5000 arrange. Dette er for å kontrollere og justere konsentrasjonen sortering porter, om nødvendig, før sorteringen. Vi anbefaler en stram gate i sentrum av virale partikler. Også, for å generere porter bruker vi SYBR Grønn og FSC PMT plot.
- Tilsett 5 ul av 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose (i TBE-buffer) avkjølt til 37 ° C for hvertgodt på en polytetrafluoroethylene (PTFE) objektglass (elektronmikroskopi Sciences).
- Laste PTFE mikroskop lysbilde i strømningscytometeret å fange sortert viruspartikler.
- Begynn slags SYBR grønn farget viruspartikler direkte på PTFE lysbilde med LMP agarose. Vi anbefaler sortering 10 eller flere arrangementer (viruspartikler) i enkelte brønner for å hjelpemiddel for påvisning av dybden av virus i løpet av konfokal laser-skanning mikroskopi (CSLM).
- Når sortering er fullført, fjerner lysbilde fra strømningscytometeret og tilsett 5 pl mer LMP agarose avkjølt til 37 ° C til hver brønn, og dermed bygge den viral partikkel (s).
3. Visualisere Enkelt Virioner hjelp konfokalmikroskopi
Hvis et enkelt virion er ønskelig, deretter avgjøre om hver brønn inneholder en individuell viruset er avgjørende og CLSM er nødvendig for å visualisere det innebygde virion (e) i 3D for å verifisere at bare en enkelt partikkel er til stede, og at flere virusstables på toppen av hverandre.
- Sett i mikroskop laseren til bølgelengde 488 nm eksitasjon.
- Bilde den innebygde viruspartikler ved hjelp av en 63X lang arbeidsavstand objektiv.
4. Hele Genome Amplification
- Når brønner med enkelt virus er identifisert med CLSM, utføre hele genomet forsterkning ved hjelp av flere forskyvning forsterkning (MDA) i agarose (in situ).
- For å redusere sannsynligheten for å innføre DNA-kontaminering, fjern de ønskede agarose 'perler' fra raset og plassert i et sterilt PCR rør. Bruk et par av sterile pinsetter og / eller barberblad for dette trinnet.
- Lyse den virale partikkel in situ ved hjelp av varme (94 ° C) i 3 min i varme-blokk med en thermocycler.
- Utfør MDA reaksjon etter produsentens anbefalinger (GenomiPhi HY kit, GE Healthcare) med følgende modifikasjoner
- Reduser volumet av prøven og reaksjonen buffers til 11.25 ul og inkuberes ved 30 ° C i maksimalt to timer for å redusere ikke-spesifikk forsterkning.
- Rens det amplifisert genomisk materiale ved å overføre genomisk DNA (gDNA) til et 1,7 ml Eppendorf-rør og tilsett 1/10 volum 3 M natriumacetat (NaOAc) i TBE-buffer (samme buffer brukt i LMP-agarose forberedelse).
- Plasser prøven (e) ved 55 ° C i 10 min for å oppløse agarosen.
- Bevege røret (r) til 42 ° C for å redusere temperaturen før de tilsettes enzym.
- Tilsett 2 enheter β-agarase til hvert rør og inkuberes i 2 timer.
- Tilsett 1 volum av en buffer-mettet fenol til røret, blandes kraftig og sentrifuger ved 3500 xg i 15 min. Overfør supernatanten inneholder DNA til en ny 1,7 ml Eppendorf tube.
- Legg ett volum på 100% isopropanol og 1μl av Glycoblue. Bland godt ved å snu røret.
- Sentrifuger ved 28000 x g ved 4 ° C i 60 min. Dekanter isopropanol sørge for ikke å forstyrre pelleten. Tilsett 150 ul 70% etanolnol til hvert rør. Snurr på 28.000 xg og RT i 10 min. Dekanter etanol, lufttørker DNA-pellet og resuspender DNA i et egnet volum av TE-buffer.
- Vi anbefaler å gjenta trinn 04.04 til 04.09 med følgende modifikasjoner. Sett opp 3-5 replikate MDA reaksjoner og redusere inkubering ved 30 ° C til 1 time. Pool prøvene etter rensing og bunnfallet ved hjelp av 95-100% etanol for å oppnå ønsket konsentrasjon.
5. Representant Resultater
Figur 1 oppsummerer SVG prosessen. Disse metodene brukes flowcytometri å sortere virale partikler på PTFE mikroskopglass inneholdende agarose for å isolere enkelt-virioner fra et blandet samling etterfulgt av MDA å skaffe mengder gDNA som er tilstrekkelige for sekvensering.
Som et proof-of-concept ble bakteriofag lambda og T4 blandet og underkastet den SVG prosessen 11.. Når virions ble tatt til fange og innebygd i agarose, CLSM was brukes til å visualisere og bekrefte at et enkelt virion var oppnådd;. Resultatene er vist i figur 2. Når brønner med enkle virioner ble identifisert, ble de valgt for MDA av gDNA. Vi deretter brukt multipleks PCR spesifikke for T4 og lambda å identifisere virion isolert, figur 3. En isolert fag-lambda genom ble valgt for sekvensering.
Genome sekvensering ble utført ved hjelp av 454-titan-teknologi og sekvensering lesninger ble underkastet referere kartlegging for å identifisere graden av dekning oppnås ved hjelp SVG. Figur 4 viser at nesten hele lambda genomet ble gjenvunnet (med unntak av de første 5 bp).
Figur 1. SVG metodikk. Viral suspensjoner som inneholder en blandet samling er redusert til enkle viruspartikler via flowcytometri som er så sorted på enkelte agarose "perler". Viruset er integrert i agarose perle ved overliggende med et ekstra lag av agarose post flowcytometrisk sortering. Endelig er hele genomet forsterkning utføres in situ.
Figur 2. Confocal laserskanning micrograph av en sortert viruspartikkelen innebygd i en agarose perle. A) Tredimensjonal rekonstruksjon av en SYBR Grønn I-farget viral partikkel i en agarose perle. Innfelt: høyere forstørrelse av den isolerte viral partikkel B) Profil tomt på relativ fluorescens av farget enkelt viral partikkel i en agarose perle..
Figur 3. Bakteriofag identifisering ved hjelp av PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR ved hjelp av T4 og lambda-spesifikke primere til genotype, Lanes: 1. TrackIt en kb pluss ladder (Invitrogen), to. lambda integrase (750 bp), tre. T4 store capsidproteinet (1050 bp), 4.. . Blanding av lambda integrase og T4 store capsidproteinet B) Etterfølgende lambda spesifikk PCR med flere loci å ytterligere bekrefte fag genom isolasjon, Lanes: 1. Lambda integrase (750 bp), to. Lambda repressor (356 bp) tre. Lambda sie (superinfeksjon eksklusjon) (456 bp) 4. TrackIt en kb pluss ladder (Invitrogen).
Figur 4. Lambda genom attributter og dekning. A) GC tomt, B) Genome kart av lambda (tilpasset fra http://img.jgi.doe.gov ), og C) Kartlegging av SVG leser til referansen bakteriofag lambda, er x-aksen genom posisjon, yaXIS er% dekning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En rekke viktige faktorer som må tas i betraktning når du søker SVG tilnærminger. Genotyping, som ble utført i løpet av proof-of-concept eksperiment 13, er ikke et gyldig alternativ for miljø eller ukjente isolater som bevarte primere er ikke tilgjengelig på tvers av alle virus-grupper. Dessuten er bakgrunnen DNA syntese eller uspesifikke forsterkning ofte rapportert under forsterkning ved hjelp av MDA reaksjon 14. Ikke-spesifikk amplifikasjon har blitt tilskrevet kontaminerende DNA dukker opp fra reaksjons-reagenser og / eller gjennom en mekanisme som muliggjør amplifikasjon fra de tilfeldige heksamer i reaksjonsblandingen. Når man arbeider med virale sammenstillinger, er det kanskje en høyere sannsynlighet for ikke-spesifikk DNA-molekyler fortrinnsvis forsterket på grunn av den lavere mengde av templat virus-DNA i motsetning til enkle bakterieceller som et resultat av den betydelige forskjellen i partikkelstørrelse (celle) størrelse og genomiske DNA-innhold ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg for virus, sommotsetning til 0.2-1.5 um; ~ 14 fg for bakterier). Følgende metoder er anbefalt å redusere nivået av ikke-spesifikk forsterkning: behandling av virale sammenstillinger med DNase I, undersøkelse av virus som inneholder agarosekuler hjelp CLSM, reduksjon av MDA inkubasjonstid og økt sekvensering dybde (dvs. som er i stand til med neste generasjons sekvensering teknologi som 454-Titanium og Illumina).
Når du utfører SVG på miljøprøver, er optimalisert de novo montering viktig å få fullstendig eller nær komplett genom sekvenser. Vi har funnet at å redusere overflødige leser før montering er nødvendig for å oppnå bedre dekning 13..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Ken Nealson for hans innsikt og rådgivning gjennom hele manuskriptet forberedelsesprosessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F.
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D.
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
