Enkelt virus Genomics (SVG) er en metode for å isolere og forsterke genomet av single virons. Virale suspensjoner av en blandet samling sorteres ved hjelp av flow cytometri på et objektglass med diskrete brønner inneholdende agarose, for derved å fange virion og redusere genomet klipping under nedstrøms bearbeiding. Hele genomet forsterkning oppnås ved bruk av multippel forskyvning forsterkning (MDA) som resulterer i genomisk materiale som er egnet for sekvensering.
Abstract
Hele genomet forsterkning og sekvensering av single mikrobielle celler gjør genomisk karakterisering uten behov for dyrking 1-3. Virus, som er allestedsnærværende og de mest tallrike enheter på planeten vår 4 og viktig i alle miljøer 5, har ennå ikke avslørt via lignende tilnærminger. Her beskriver vi en tilnærming for å isolere og karakterisere de genomer av single virions kalt "enkelt virus Genomics '(SVG). SVG benytter strømningscytometri for å isolere individuelle virus og hele genomet forsterkning for å oppnå høy molekylvekt genomisk DNA (gDNA) som kan anvendes i de følgende reaksjoner sekvensering.
Protocol
En. Utarbeidelse av Viral utestengelse Før isolering av enslige virions via flowcytometri, forberede ufestede viral suspensjoner. Isolere virale partikler ved hjelp av tidligere etablerte protokoller som gjør sikker endelige virale suspensjon er inneholdt i 0,1 um-filtrert TE (Tris-EDTA, pH 8). Vi anbefaler å bruke tangentialfiltrering filtrering (TFF) nærmer seg seks selv om andre metoder har blitt utviklet som bruker kjemisk flokkulering 7. Nu…
Discussion
En rekke viktige faktorer som må tas i betraktning når du søker SVG tilnærminger. Genotyping, som ble utført i løpet av proof-of-concept eksperiment 13, er ikke et gyldig alternativ for miljø eller ukjente isolater som bevarte primere er ikke tilgjengelig på tvers av alle virus-grupper. Dessuten er bakgrunnen DNA syntese eller uspesifikke forsterkning ofte rapportert under forsterkning ved hjelp av MDA reaksjon 14. Ikke-spesifikk amplifikasjon har blitt tilskrevet kontaminerende DNA dukker …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Ken Nealson for hans innsikt og rådgivning gjennom hele manuskriptet forberedelsesprosessen.
Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).