Summary
Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.
Abstract
Existe um grande conjunto de provas indica que os novos neurónios funcionais são constitutivamente gerada a partir de um pool de endógena das células estaminais neurais em áreas restritas do cérebro de mamíferos adultos. Neuroblastos-nascidos da zona subventricular (SVZ) migram ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para seu destino final no bulbo olfatório (OB) 1. No RMS, neuroblastos migram tangencialmente em cadeias ensheathed por processos astrocíticos 2,3 utilizando vasos sanguíneos como um suporte estrutural e de uma fonte de factores moleculares necessários para a migração de 4,5. No OB, neuroblastos destacar das cadeias e migram radialmente em diferentes camadas bulbares onde se diferenciam em interneurônios e integrar a rede existente 1, 6.
Neste artigo, descreve o procedimento para a migração de células de controlo em fatias agudas do cérebro de roedores. O uso de fatias agudas permite a assessment de migração celular no microambiente que se assemelha a condições in vivo e em regiões do cérebro que são de difícil acesso por imagem in vivo. Além disso, evita-se a cultura de longo condição, como no caso de culturas organotípicas célula e que pode, eventualmente, alteram as propriedades de migração das células. Precursores neuronais em fatias agudas podem ser visualizados usando óptica DIC ou proteínas fluorescentes. Rotulagem viral de precursores neuronais no SVZ, neuroblastos enxerto de ratos repórter no SVZ de ratinhos de tipo selvagem, e utilizando ratinhos transgénicos que expressam a proteína fluorescente em neuroblastos são todos os métodos adequados para a visualização de neuroblastos e na sequência da sua migração. O método mais tarde, no entanto, não permite que as células individuais a serem rastreados por longos períodos de tempo, devido à elevada densidade de células marcadas. Foi utilizado um microscópio de campo amplo fluorescente vertical equipado com uma câmara CCD para obter um intervalo de aquisição relativamente rápida (uma image cada 15 segundos, ou 30) para identificar com segurança as fases estacionária e migratórias. A identificação precisa da duração das fases estacionárias e migratório é crucial para a interpretação inequívoca dos resultados. Também realizamos várias z-passo aquisições para monitorar a migração neuroblastos em 3D. De campo amplo imagem fluorescente tem sido amplamente utilizado para a visualização de migração neuronal 7-10. Aqui, nós descrevemos protocolo detalhado para a marcação de neuroblastos, executando em tempo real de imagens de vídeo de migração dos neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior do rato adulto, e analisando a migração celular. Embora o protocolo descrito exemplificado a migração dos neuroblastos da RMS adulto, ele também pode ser usado para seguir a migração de células em cérebros embrionários e pós-natais cedo.
Protocol
1. Rotulagem precursores neuronais
Neuroblastos podem ser visualizados utilizando ratinhos transgénicos que selectivamente expressam proteínas fluorescentes em neuroblastos (ie, Dcx-GFP, GAD67-GFP), por estereotaxicamente injectando partículas virais que codificam as proteínas fluorescentes na SVZ ou RMS, ou por enxerto de precursores neuronais de ratos repórter (ou seja, , Dcx-GFP, GAD67-GFP) no SVZ de ratinhos de tipo selvagem. Nós descrever o processo de enxertia e rotulagem viral de precursores neuronais.
A dissociação dos neuroblastos da SVZ de ratinhos repórter
- As soluções que se seguem são necessários para a dissociação dos neuroblastos.
Solução 40X
10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10.000 u / ml / Strept 1000 ug / ml)
10 ml de glucose (Stock 200 mg / ml)
20 ml de piruvato de sódio (mM de Stock 100)
ove_content "> 10 ml de H 2 OPreparar alíquotas de 1 ml
Solução de dissecção (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
Solução 40X - 2,5 ml
DNase solução (20K unidades / ml)
ADNasel, typeIV de pâncreas de bovino
150.000 unidades dissolver em 7,5 ml de H 2 O
Filtrado 0,22 um
Preparar alíquotas de 1 ml
Tripsina-ADNasel solução (10 ml)
- 8,6 ml de HBSS
ADNasel (20K unidades / ml) - 0,15 ml
Tripsina-EDTA (0,5%) - 1 ml
Solução 40X - 0,25 ml
A trituração solução (50 ml)
ntent "medium> Neurobasal - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 ul
Solução 40X - 1,25 ml
ADNasel (20K unidades / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize de dois a três meses de idade, de ratinho adulto que expressa uma proteína fluorescente em neuroblastos com uma injecção intraperitoneal de 100 ul de cetamina / xilazina (10 mg / 1 mg por 10 g de peso corporal), então decapitar. Usamos GAD67-GFP ratos 11. Usando o bisturi, cortar o cérebro coronalmente a nível do ventrículo lateral, e dissecar o SVZ em meio de dissecção gelado frio. Coloque a SVZ num tubo de microcentrífuga com 500 ul de tripsina DNase solução, e manter em gelo durante 20 min.
- Transferir a SVZ para um tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml da pré-aquecido (37 ° C) uma solução de tripsina DNase-e incubar a 37 ° C em um 5% de CO2 durante 30 min.
- Transferir todo o conteúdo para um tubo cónico de 50 ml contendo 15 ml de tritsolução uração e centrifugar a 1000 g durante 1 min. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 ml de solução de trituração, a transferência das células para um novo tubo de 15 mL cónico, e centrifuga-se a 1000 xg durante 1 min.
- Fire-polimento de uma pipeta de Pasteur para reduzir o tamanho da ponta e revestimento com o meio de trituração. A seguir à centrifugação remover tanto quanto possível o sobrenadante e adicionar 2 ml de solução fresca de trituração no tubo cónico. Tritura-se as células na solução de trituração (cerca de 50 vezes para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur). Tomar a metade superior do sobrenadante, que contém células bem dissociados, e transferi-lo para um novo tubo de 15 mL cónico contendo 10 ml de solução de trituração.
- Fogo-polonês uma pipeta Pasteur de reduzir ainda mais o tamanho da ponta. Adicionar 1 ml de uma outra solução de trituração para o tubo contendo as células restantes não dissolvidas, continuar a trituração (cerca de 10 vezes para cima e para baixo), e transferir todo o conteúdo do tubo 15 containin ml cónicog de células dissociadas anteriormente. Centrifugar a 1.000 xg durante 7 min. Rejeitar o sobrenadante, re-suspender as células peletizadas em 50 ml de meio neurobasal, a carga em uma câmara de contagem e contagem de células.
Enxerto o número desejado de células no SVZ, utilizando o procedimento descrito abaixo.
Injecção estereotáxica de o vírus e enxertia de células dissociadas
- Esterilizar todos os instrumentos através de um esterilizador grânulo antes de começar a cirurgia.
- Para injecções estereotáxicas, usar micropipetas de vidro com pontas muito finas (1-2 mm) para minimizar os danos cerebrais. Para fazer uma pipeta, puxar um capilar de vidro, com um puxador de pipeta. Backfill pipeta com óleo de parafina, até metade, e inserir o êmbolo de um injector nanolitro (Precision Instruments Mundo) para dentro da extremidade da pipeta não tratada.
- Usando um injetor nanolitro controlador, forçar para baixo o óleo com o êmbolo até que uma pequena drop de óleo de parafina a extrusão a partir da ponta fina. Diminuir a pipeta para um recipiente estéril com 0,5-1 ul de uma solução contendo tanto partículas virais (1x10 6 1x10 8 TU / ml) ou células dissociadas SVZ. Utilizar a função de retirar o injector de nanolitros a encher a pipeta com a solução desejada. Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da pipeta.
- Anesthetize de dois a três meses de idade, adultos C57Bl / 6 de rato com uma injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina. Usar um barbeador elétrico para depilar o local da cirurgia na cabeça. Limpe bem com gaze molhada para remover qualquer cabelo aderente.
- Posicione o mouse sobre um quadro estereotáxico e fixar a cabeça. Lavar o local de injecção livre de cabelo com sabão desinfectante (Hibitane) e, em seguida, com álcool a 70% (gaze ou pulverização). Desinfetar o local com Proviodine (gaze ou spray) e cobrir o animal com um campo cirúrgico.
- Fazer uma pequena incisão na pele do ratinho esterilizado, e cuidadosamente espalhado na pele para exporo crânio subjacente. Seca-se a superfície do crânio. Use o bregma e linha média como as coordenadas zero para definir os ântero-posterior (AP) e médio-lateral (ML) coordenadas estereotáxicas, respectivamente.
- Faça um furo pequeno no crânio sobre cada hemisfério nas coordenadas apropriado. Evitar danificar o tecido cerebral subjacente. Perfurar com cuidado até que apenas o osso foi violado. Limpar o furo e definir as coordenadas de zero para os dorso-ventral (DV) coordenadas estereotáxicas na superfície do cérebro. Usamos seguindo coordenadas (em milímetros) para injeções no SVZ ou RMS de adultos (22-24 g) C57BL / 6: para SVZ: AP 0,70, ML 1,20 e 1,90 DV, por RMS: AP 2,55, 0,82 e ML DV 3.15.
- Lentamente, insira a ponta micropipeta de vidro para dentro do cérebro utilizando as coordenadas apropriadas DV como guias, e injectar lentamente uma pequena quantidade (injetamos nl 100-500, 5 nl / s) de suspensão de células (dissociada da SVZ de ratinhos repórter) ou um solução contendo partículas virais. Costumamos usarlentiviral ou retroviral partículas 1x10 6 1x10 8 TU / ml.
- Retirar lentamente a micropipeta de vidro, suturar a pele sobre o crânio, e coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento para a recuperação mais rápida. Quando o rato acorda após a cirurgia, administrar um analgésico (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injecção por dia, durante 3 dias pós-op).
2. Preparando fatias aguda
- As soluções a seguir são necessários para preparar fatias agudas: a) um fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF) solução de sacarose com base, designado como solução de corte, onde NaCl é substituído por sacarose para amortecer aumento da excitabilidade neuronal durante o processo de preparação do corte, e b) ACSF contendo NaCl, aqueceu-se a 32 ° C num banho de água, em que as fatias são transferidos e mantida até imagiologia.
- As soluções contêm o seguinte (em mM): solução de corte: 210,3 sacarose, 3 de KCl, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 2 CACI 2 O 26 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose; ACSF: 125 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 x2H 2 O, 26 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose. Manter as soluções com um pH de 7,3-7,4, e continuamente oxigenado por borbulhamento-los com 95% O2 / 5% de CO 2.
- Anestesiar o rato com uma administração intraperitoneal de cetamina / xilazina. Preparar solução gelada de corte com uma aparência gelatinosa utilizando azoto líquido. Perfundir o rato intracardiacaly com essa solução com uma seringa de 20 cc.
- Este procedimento deve ser efectuado rapidamente, normalmente 1-2 min para 20 ml de solução. Se os vasos sanguíneos necessita ser etiquetado, em vez de perfusão com a solução de corte, injecta-se 200 uL de transcardiacally Dextran Texas Red (10 mg / ml) para o ventrículo esquerdo do coração e esperar 2-3 min antes decapitar o rato.
- Decapitar o mouse, e rapidamente mergulhe a cabeça em solução gelada de corte. Use a tesoura para retirar o couro cabeludo, e cortar o crânio do posterior ao eixo anterior ao longo da sutura mid-sagital do cerebelo para o OB. Remova cuidadosamente as abas cranianos usando uma pinça.
- Parte do Imposto caudal do cérebro utilizando um bisturi. Cortar o cérebro ao longo da fenda intrahemispheric, e fazer dois cortes sagitais da parte mais lateral de cada hemisfério (Figura 1A). Remova cuidadosamente o cérebro com uma espátula e coloque-o em solução de corte de gelo frio.
- Colocar os dois hemisférios separadamente em um bloco de agar de 4%, com o lado dorsal tocar no agar, e cola o bloco com os dois hemisférios para a plataforma de um vibratome. Cole a lateral cortada lado do hemisfério para a plataforma, mantendo lado medial para cima (Figura 1B). Coloque a plataforma na câmara do vibratome e preencha com a solução de corte. Manter a solução oxigenada em todo o slice preparação por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2.
- Preparar 250 um de espessura, usando o vibratome. Usamos uma Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) e cortar as fatias a uma frequência de 100 Hz e uma velocidade de 1 mm / seg. A velocidade de corte baixa e alta frequência de vibração da lâmina deve ser utilizada para obtenção de cortes de alta qualidade. Assim que uma fatia é libertado a partir da lâmina, retire-o da solução de corte e colocá-la numa câmara de incubação preenchido com ACSF oxigenado mantida a 32 ° C num banho de água (Figura 1C).
Este procedimento deve ser realizado tão rapidamente quanto possível para assegurar que as fatias de melhor qualidade.
3. Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos
A imagiologia de neuroblastos em migração deve ser realizada dentro de 6-8 horas de preparação das fatias e 3-10 dias após a marcação neuroblastos. Para evitar alterações nos parâmetros de migraçãopor causa da injecção estereotáxica de que pode induzir danos no cérebro e activação glial uso microeléctrodos de vidro de ponta fina (1-2 mm) para minimizar o dano cerebral, e realizar a imagiologia nas regiões distais do local de injecção (isto é, na imagem seguinte RMS injeção na SVZ ou na RMS de bulbo olfatório após injeção no RMS). Embora a imagem pode ser realizada até 21 dias após a injecção de partículas lentivirais na SVZ, recomendamos menor intervalo pós-injecção (3-10 dias), uma vez que permite visualizar e controlar mais células por campo de vista.
Utilizou-se um amplo campo de microscópio fluorescente motorizado BX61WI (Olympus) equipado com uma câmara CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) e uma objectiva de imersão em água de 40X com uma abertura de 0,8 numérica (Olympus). Os objetivos com maior NA fornecerá imagens de melhor resolução. Neuroblastos rotulados (enxertada a partir de um camundongo doador repórter ou rotulados de forma viral) foram animadocom um Lambda DG-4 equipado com uma lâmpada de 175 W de xenônio (Sutter Instruments) para 30-100 ms por aquisição z. Multi-comprimento de onda de imagem pode também ser realizada utilizando filtros adequados (Chroma) para controlar a migração neuronal ao longo dos outros elementos celulares do RMS, como astrócitos marcadas com fluorescência ou vasos sanguíneos. O microscópio, câmara CCD e DG-4 foram controladas por software MetaMorph (Dispositivo Molecular), que permitiu que os diferentes parâmetros do lapso de tempo para programa de aquisição de ser definido (ver abaixo). As fatias foram transferidas para um PH1 Série 20 imagiologia ultra-silencioso câmara (Harvard Apparatus), construído no microscópio. A câmara foi conectada a um sistema automático de aquecimento (TC-344B, Harvard Apparatus) e foi continuamente perfundidos com ACSF oxigenado (Figura 1D). A temperatura na câmara foi mantida a 31-33 ° C, e a taxa de fluxo do ACSF era de 1-2 ml por min.
- Cuidadosamente colocar a fatia na câmara de formação de imagens do microscópio. Paraevitar a deriva de fatia durante a imagiologia, de estabilizá-la cuidadosamente colocando uma malha de nylon (Warner Instruments) na parte superior da fatia. A malha é de 0,12 mm de espessura e o intervalo de aberturas de 0,3-1,13 mm. Posicionar a malha de modo a que não obstrua o campo de imagem (Figura 1D). Use uma objetiva de 10X para encontrar um campo de interesse, e então acione o objetivo de 40x e ajustar o foco.
- Certifique-se de que a fatia é continuamente perfundidos com ACSF e que não há solução suficiente entre o objetivo eo da fatia. As alterações na taxa de ACSF perfusão, a perfusão irregular, ou variações bruscas de temperatura, faz com que deriva e alterações no plano focal durante o exame.
- Definir os parâmetros de lapso de tempo de aquisição (isto é, duração de excitação, o número de planos de z, a distância entre cada secção z-, intervalo de tempo e duração da gravação), utilizando o software MetaMorph, que controla o sistema de aquisição e iniciar o tempo de caducar aquisição. Data é automaticamente salvo pelo MetaMorph como uns arquivos TIFF com cada arquivo correspondente a um ponto do tempo adquiriu lapso de tempo vídeo.
- Executar a imagiologia por pelo menos 1-2 horas e ter em consideração as fases migratórias que são interrompidos por duas fases estacionárias. A imagem pode ser realizada por até 4 h (não realizamos sessões de imagem que duram mais de 4 horas), sem quaisquer alterações nas propriedades de migração dos neuroblastos. Fazer células não de imagem na superfície da fatia. Nós imagem normalmente, a uma profundidade de 20 a 100 um. Recomendamos utilizando intervalos de aquisição curtos (15 - 30 segundos) para determinar com fiabilidade o início eo fim do estacionário e fases de migração.
- Para avaliar o envolvimento de factores específicos moleculares na migração dos precursores neuronais, ACSF normal pode ser substituído com ACSF contendo qualquer agente farmacológico desejado (isto é, diferentes agonistas, antagonistas, bloqueadores, factores de crescimento, etc.) Realizar imagem para, pelo menos,1 hora em condições de controlo e, em seguida, durante 1 hora, na presença do agente farmacológico.
4. Analisando migração neuroblastos
Usamos Imaris software (bitplane) para analisar os dados. Isso nos permite controlar automaticamente a migração de células recém-nascido em 3D. O pacote inclui o Imaris 7.0F1 MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filamento Tracer, e módulos Inpress.
- Para abrir o filme em Imaris, carregar as imagens adquiridas (tiff), simplesmente arrastando e soltando a imagem do primeiro ponto de tempo do vídeo sobre o ícone do programa.
- Uma vez que o filme é carregado, ajustar o brilho eo contraste do sinal na janela de ajuste de exibição, e definir os parâmetros do vídeo adquirida (tamanho do voxel e intervalo de tempo) nas propriedades de imagem e defina o tempo equidistante pontos janelas (Fig. 4A) . Depois de especificar o tamanho do voxel, é possível ver a estrutura em 3D, bem como o tempo e a escala devídeo.
- Para rastrear automaticamente células gravadas, criar um ponto para cada célula no campo na janela Surpass, escolhendo a função Spots. Siga os passos, e definir os parâmetros com base nos objetos clonados (Figura 4B). Um dos parâmetros é o diâmetro da célula que pode ser medido na janela de fatia.
- Inspecione a confiabilidade dos objetos detectados ao longo do tempo. Se todas as células migrantes não forem detectadas automaticamente, alterar o limiar de detecção (Figura 4B), e assegurar que todas as células foram seleccionadas com pontos em todos os pontos de tempo.
- Durante rastreamento automático, se dois objetos de vizinhos tempo-points tem alguma sobreposição entre suas fronteiras / bordas, uma conexão de faixa será feita para cada sobreposição. A distância máxima e tamanho de abertura máxima (Figura 4C) entre dois pontos que representam pontos de tempo vizinhas da mesma faixa tem de ser especificada de modo a que o programa possa ligar o tempo points. A distância máxima é determinada pela distância entre o mesmo objecto em pontos temporais posteriores.
- Uma vez que as faixas são feitos, é possível filtrar as faixas e remover as faixas irrelevantes, simplesmente excluindo a eles (Figura 4C). As faixas podem ser corrigidos pelo ligar e desligar faixas diferentes e pontos de tempo diferentes da mesma faixa (Figura 4C).
- Uma vez que todas as correções foram feitas, dê uma olhada final nos trilhos e exportar os dados (deslocamento de células por ponto de tempo, comprimento da pista, comprimento de deslocamento, a duração pista etc) para um arquivo do Excel (Figura 4D).
5. Resultados representativos
Nós testamos e otimizada de imagem de campo largo lapso de tempo de migração neuroblastos. Rotulagem viral ou enxertia de neuroblastos marcadas com fluorescência na SVZ permitiu a expressão da GFP em células migratórias robusta (Figura 2). Multi-comprimento de onda de imagem pode be aplicado a visualizar a migração dos neuroblastos juntamente com os restantes elementos celulares do RMS tais como vasos de dextrano TexasRed-cheias de sangue 4 (Figura 3 e Filme 1), astrócitos marcadas por fluorescência por injecção estereotáxica de vírus com um promotor específico de células gliais (Figura 2B) 12, ou especificamente marcado astrócitos em animais transgénicos.
De grande campo de imagem de vídeo de migração dos neuroblastos em fatias agudas revelou o comportamento de migração saltatory precursores neuronais compostas por duas fases distintas: o deslocamento do corpo da célula neuronal para o processo principal separadas por uma fase estacionária (Figura 3, Filmes 1 e 2) . Para identificar com segurança a duração das fases estacionárias e migratórias e derivar os parâmetros de migração outras células, tais como a taxa de deslocamento (calculado apenas durante as fases de migração), imagiologia foi realizada em 3D utilizando um intervalo de aquisição curta (uma vez por cada 15 ou 30 seg). A identificação precisa das durações das fases estacionárias e migração é fundamental para a interpretação inequívoca de dados. Por exemplo, as diferenças na distância de migração durante um determinado período de tempo pode ser induzida tanto por variações da taxa de migração ou por modificações na duração ou periodicidade da migração e fases estacionárias. Estas diferentes possibilidades não podem ser distinguidos utilizando intervalos de aquisição de comprimento.
Imaris software foi utilizado para analisar a migração dos neuroblastos em 3D e derivar os parâmetros adicionais de migração de células tais como a duração pista e comprimento da faixa, bem como duração da faixa de deslocamento, que é um vector de deslocamento. A linearidade faixa pode também ser calculado dividindo o comprimento do percurso de deslocamento do comprimento de pista e indica a linearidade do percurso de migração dos neuroblastos individual.
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Figura 1. Representação esquemática da preparação de fatias agudas vivos. Uma representação) esquemática de um caudal, uma intrahemispheric e dois cortes sagitais. B) Representação esquemática da colocação do cérebro do rato no bloco de agar e plataforma do vibratome. C) Representação esquemática da câmara aguda fatia de incubação. D) Representação esquemática da câmara de imagem construído no microscópio vertical.
Figura 2. Rotulagem de neuroblastos na RMS. A) imagem baixa ampliação mostrando rotulagem robusto de neuroblastos e vasos sanguíneos no RMS adulto. A GFP codificação retrovírus foi injectado no SVZ, e as células que expressam GFP-(verde) foram detectados na RMS após 3 dias (painel da esquerda). Os vasos sanguíneos foram rotulados pela injeção de dextrano TexasRed no coração do mouse (vermelho, painel direito). A inserção mostra uma magnífica altaimagem ção dos vasos sanguíneos e neuroblastos virally rotulados associada aos vasos sanguíneos. B) Rotulagem de diferentes elementos celulares no RMS adulto. Neuroblastos foram marcadas por injecção mCherry codificação lentivirus no SVZ (vermelho), os astrócitos foram marcadas por injecção de um lentivírus codificação GFP sob o controlo de um promotor GFAP no RMS (verde), e os vasos sanguíneos foram marcadas por injecção de dextrano CascadeBlue (azul ), no coração. C) Representação esquemática da injecção de GAD67-GFP a partir de células dissociadas de um rato SVZ GAD67-GFP no SVZ de rato de tipo selvagem adulto. D) transplantados GAD67 GFP células (verde) detectou nos 7 dias após a enxertia RMS no SVZ. O RMS é imunocoradas com GFAP (azul). E) transplantados GAD67 GFP células (verde) foram imunopositividade para Dcx (vermelho), mas foram immunonegative para GFAP (azul). Clique aqui para ver maior figura.
Figura 3. Lapso de tempo de imagem de neuroblastos. Imagens com lapso de tempo de neuroblastos (verde) a migração ao longo dos vasos sanguíneos (vermelho). As setas indicam as fases de migração dos neuroblastos, e as setas indicam as fases estacionárias.
Figura 4. Análise da migração dos neuroblastos. (AD) etapas diferentes de neuroblastos análise de migração. Os círculos vermelhos indicam as diferentes funções mencionadas no texto. Clique aqui para ver maior figura .
Vídeo 1. Lapso de tempo de imagem de neuroblastos virally rotulados (verde) a migração ao longo dextrano TexasRed vasos sanguíneos marcados (vermelho). Clamber aqui para ver o vídeo.
Vídeo 2. Rastreamento migração neuroblastos pelo software Imaris. Pontos verdes indicam corpos celulares e faixas indicam a distância da migração. Clique aqui para ver o vídeo .
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Discussion
O direccionamento correcto de precursores neuronais para as regiões do cérebro adequadas é um processo fundamental subjacente a montagem correcta e função dos circuitos neurais. A grande maioria das células migram durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal no cérebro apenas em poucas regiões, tais como o giro, OB denteado e cerebelo, o deslocamento neuronal ainda ocorre. Os mecanismos de orquestrar a migração de células no cérebro pós-natal, contudo, permanece pouco compreendido. O conhecimento dos mecanismos e vias moleculares envolvidos na orientação de migração celular em tecidos nervosos maduros irá melhorar a nossa compreensão dos direccionamento neuronal no cérebro pós-natal e podem ter relevância clínica para o desenvolvimento de novas estratégias para induzir recrutamento neuronal em áreas doentes do cérebro.
Neste artigo, nós descrevemos um protocolo para a migração de células de monitoramento em fatias agudas do cérebro anterior do rato adulto. Enquanto nós usamos o adulto SVZ-OBvia como um sistema modelo, a mesma técnica pode ser aplicada a seguir a migração de células nos cérebros embrionários e pós-natal precoce, bem como no adulto após lesão cerebral. Usamos este protocolo para acompanhar a migração celular no RMS pós-natal 12, cerebelo e estriado pós-AVC adulto (Eiriz, Grau, Malva e Saghatelyan, dados não publicados).
Imagiologia de migração dos neuroblastos foi realizada utilizando fatias agudas vivo, que permitem a migração de células a ser estudado num microambiente que imita as condições in vivo. As células que migram foram visualizadas tanto por injecções estereotáxicas de partículas virais ou por enxertia neuroblastos de ratinhos repórter no SVZ de ratinhos de tipo selvagem. A análise de migração foi realizado longe do local de injecção. Para estudar a migração tangencial no RMS, preparamos fatias agudas 3-5 dias após os neuroblastos foram marcadas. Para estudar a migração radial no OB, as fatias foram preparadas de 7-10 dias após uma steinjecção reotaxic no SVZ. Alvo viral de precursores neuronais no adulto SVZ pode ser igualmente utilizado para estudar e modular factores envolvidos no processo de migração ou por upregulating downregulating específicos pistas moleculares. É também possível marcar diferentes tipos de células no RMS e executar multi-comprimento de onda de imagem para desvendar o padrão de migração ao longo de vasos sanguíneos neuroblastos traçadores cheios 4, 13 ou ao longo de astrócitos viralmente ou geneticamente marcados 2, 12.
Para migração neuroblastos imagem usamos um microscópio de fluorescência motorizada vertical equipado com uma câmera CCD, que permitiu aquisições relativamente rápidos em diferentes planos z seguintes pulsos curtos (30-100 milissegundos) de luz de excitação. Isto impediu fotodegradação e diminuiu o intervalo de tempo entre duas aquisições posteriores, sem interferir com a visualização 3D de migração neuroblastos. Outros grupos usaram microscopia confocal ou dois fótons para monitorar MIGR celularção na RMS pós-natal 14-16. Ambas as técnicas têm suas vantagens e limitações, que são principalmente relacionados a questões temporais e espaciais resoluções. Recomendamos a utilização de intervalos curtos (15-30 seg) entre as aquisições sucessivas. Neurônios têm comportamento saltatória, e fases de migração são interrompidos por períodos fixos que podem ser tão breves quanto 4-10 min 4. Dado este tipo de migração, é importante a utilização de intervalos de aquisição relativamente rápidos (15-30 seg) entre os pontos de tempo sucessivos para identificar com segurança o início eo final da migração e fases estacionárias. Isto é difícil de conseguir, quando o intervalo de tempo entre duas aquisições sucessivas está no intervalo de alguns minutos. A determinação precisa das fases estacionárias ea migração é necessário para definir de forma inequívoca a velocidade de migração dos neuroblastos, que devem ser quantificados apenas durante as fases de migração 4, 17. Intervalos de aquisição longos permite calcular a valores normaisvelocidade e distância percorrida como ao longo de um certo período de tempo, que também inclui as fases estacionárias. As alterações na velocidade média definida por este método, no entanto, pode ser causada pela diferença na taxa de migração (definidos somente durante as fases de migração) ou por a duração da fase estacionária e migração. Estas diferenças nos parâmetros de aquisição sejam subjacentes às as discrepâncias nas velocidades de migração neuroblastos relatados por grupos diferentes. Através da realização de aquisições rápidas com um intervalo de 15-30 segundos e determinar a taxa de migração exclusivamente durante as fases de migração, foram calculadas a uma velocidade de migração de 120-150 mM / h 4, 12, ao passo que outros grupos, que usa um intervalo de aquisição 3-7 min relataram uma velocidade de 50-100 uM / h 14, 15, 18. A principal desvantagem do grande campo de imagem fluorescente com câmeras CCD é que ele oferece menor resolução espacial do que os sistemas de digitalização. No entanto, desde neuroblastos migram ter um morp compactohology com soma e curtas processos que levam, uma menor resolução espacial não impede a identificação segura e acompanhamento de neuroblastos no nível de corpos celulares e os processos que levam mesmo (Figura 3 e Vídeos 1 e 2).
A técnica que descrevemos aqui permite a migração dos neuroblastos em um microambiente mimetizando condições in vivo para serem analisados, as interações entre os diferentes componentes do RMS a ser estudado, e os papéis dessas interações na migração neuroblastos a ser investigado.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma Canadian Institutes of Health Research (CIHR) subvenção para ASJK foi parcialmente financiado por uma bolsa Université Laval. AS é o destinatário de uma Cátedra de Pesquisa do Canadá em neurogênese pós-natal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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