Summary
हम माउस अग्रमस्तिष्क में neuronal प्रवास के videoimaging वास्तविक समय के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. virally लेबल या grafted neuronal व्यापारियों के प्रवास तीव्र जीना एक अपेक्षाकृत तेजी से अधिग्रहण के अंतराल के साथ व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करने के लिए स्थिर और प्रवास चरणों durations और की गति सहित, सेल प्रवास के विभिन्न चरणों का अध्ययन स्लाइस में दर्ज की गई थी प्रवास.
Protocol
1. Neuronal पूर्ववर्ती लेबलिंग
Neuroblasts देखे जा ट्रांसजेनिक चूहों कि चुनिंदा neuroblasts में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (यानी, DCX GFP, Gad67 GFP) stereotaxically वायरल SVZ या आरएमएस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग कणों इंजेक्शन लगाने के द्वारा, का उपयोग कर सकते हैं, या रिपोर्टर चूहों से neuronal व्यापारियों कलम बांधने का काम (यानी DCX GFP, Gad67 GFP प्रकार के जंगली चूहों की SVZ में). हम कलम बांधने का काम और neuronal व्यापारियों के वायरल लेबलिंग के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है.
संवाददाता चूहों के SVZ से neuroblasts की हदबंदी
- निम्न समाधानों neuroblast हदबंदी के लिए आवश्यक हैं.
40X समाधान
10 मिलीलीटर पेन / Strept (स्टॉक पेन 10,000 / u / एमएल Strept 1,000 स्नातकीय / एमएल)
10 मिलीलीटर ग्लूकोज (स्टॉक 200 मिलीग्राम / एमएल)
20 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट (शेयर 100 मिमी)
"ove_content> 10 मिलीलीटर एच 2 हे1 मिलीलीटर aliquots तैयार
विच्छेदन समाधान (100 मिलीलीटर)
HbSS 1X - 97.4 मिलीलीटर
HEPES (1 एम) - 0.1 मिलीलीटर
40X समाधान 2.5 मिलीलीटर
DNase समाधान (20K इकाइयों / एमएल)
गोजातीय अग्न्याशय से DNaseI, typeIV
150.000 इकाइयों 7.5 मिलीलीटर एच 2 ओ में भंग
0.22 सुक्ष्ममापी छनित
1 मिलीलीटर aliquots तैयार
ट्रिप्सिन DNaseI समाधान (10 मिलीलीटर)
8.6 मिलीलीटर - HbSS
(20K इकाइयों / मिलीलीटर) DNaseI - 0.15 मिलीग्राम
ट्रिप्सिन-EDTA (0.5%) - 1 मिलीलीटर
40X समाधान - 0.25 मिलीग्राम
विचूर्णन समाधान (50 मिलीलीटर)
ntent> Neurobasal मध्यम - 47.5 मिलीलीटरBSA (300 मिलीग्राम / एमएल) - 332.5 μl
40X समाधान - 1.25 मिलीग्राम
(20K इकाइयों / मिलीलीटर) DNaseI - 0.66 मिलीग्राम
- Anesthetize दो से तीन महीने की उम्र में वयस्क ketamine / xylazine (10 मिग्रा / 1 मिलीग्राम प्रति शरीर के वजन के 10 ग्राम) के 100 μl के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ neuroblasts में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त माउस, तो सिर काटना. हम GAD67 - GFP चूहों 11 का उपयोग करें. स्केलपेल का उपयोग करना, मस्तिष्क coronally पार्श्व वेंट्रिकल के स्तर पर, टुकड़ा और बाहर बर्फ ठंड विच्छेदन मध्यम में SVZ टुकड़े करना. में trypsin DNase समाधान के 500 μl साथ SVZ microcentrifuge ट्यूब, जगह और 20 मिनट के लिए बर्फ पर रख.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार पूर्व गर्म 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में SVZ स्थानांतरण (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin DNase और 37 पर समाधान सेते ° सी 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार trit की 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में संपूर्ण सामग्री स्थानांतरणuration समाधान और 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate विचूर्णन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, और 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं हस्तांतरण.
- एक पाश्चर विंदुक आग पॉलिश टिप आकार और कोट विचूर्णन माध्यम से कम. निम्नलिखित centrifugation के रूप में संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला की बहुत दूर है, और शंक्वाकार ट्यूब ताजा विचूर्णन समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ने. महीन चुर्ण बनाना विचूर्णन समाधान में कोशिकाओं (लगभग 50 पाश्चर विंदुक के साथ और समय नीचे). तैरनेवाला है, जिसमें अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं के ऊपरी आधे ले लो, और यह एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार विचूर्णन समाधान के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में स्थानांतरित कर सकते हैं.
- आग पॉलिश एक पाश्चर विंदुक आगे टिप आकार को कम. विचूर्णन ट्यूब शेष undissociated कोशिकाओं से युक्त करने के लिए समाधान के एक और 1 मिलीग्राम, विचूर्णन (मोटे तौर पर 10 बार ऊपर और नीचे) जारी है, और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब containin संपूर्ण सामग्री को स्थानांतरितछ पहले dissociated कोशिकाओं. 7 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला त्यागें, neurobasal मध्यम, एक गिनती कक्ष में लोड के 50 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से स्थगित करता है, और कोशिकाओं गिनती.
भ्रष्टाचार प्रक्रिया का उपयोग SVZ में कोशिकाओं की वांछित संख्या नीचे वर्णित है.
वायरस की Stereotaxic इंजेक्शन और dissociated कोशिकाओं की ग्राफ्टिंग
- सभी सर्जरी शुरू करने से पहले एक मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग उपकरणों जीवाणुरहित.
- Stereotaxic इंजेक्शन के लिए बहुत पतली युक्तियाँ (1-2 सुक्ष्ममापी) के साथ कांच micropipettes का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क क्षति को कम से कम करने के लिए. एक विंदुक बनाने के लिए, एक एक विंदुक डांड़ी के साथ केशिका गिलास खींच. Backfill पैराफिन तेल के साथ जब तक आधा भरा पिपेट, और विंदुक अनुपचारित अंत में एक nanoliter सुई लगानेवाला (विश्व परिशुद्धता उपकरण) की सवार डालने.
- एक nanoliter सुई लगानेवाला नियंत्रक का उपयोग करना, सवार के साथ एक छोटे से dro जब तक तेल नीचे बलपैराफिन तेल के पी पतली नोक से extrudes. या तो वायरल कणों (1x10 6 1x10 8 टीयू / एमएल) या dissociated SVZ कोशिकाओं से युक्त समाधान के एक बाँझ गोदाम में 0.5-1 μl विंदुक कम. Nanoliter सुई लगानेवाला के समारोह निकालने का प्रयोग वांछित समाधान के साथ विंदुक को भरने के लिए. सुनिश्चित करें कि वहाँ विंदुक के अंदर कोई हवाई बुलबुले हैं.
- Anesthetize दो से तीन महीने की उम्र में वयस्क / ketamine / xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ 6 माउस C57BL. एक बिजली के रेजर का उपयोग करने के लिए सिर पर शल्य साइट दाढ़ी. गीला धुंध के साथ अच्छी तरह से साफ करने के लिए किसी भी पक्षपाती बालों को हटाने के लिए.
- Stereotaxic फ्रेम पर माउस रखें और सिर को ठीक. निस्संक्रामक (Hibitane) साबुन और फिर 70% शराब (धुंध या स्प्रे) के साथ के साथ बाल मुक्त इंजेक्शन साइट से धो लें. Proviodine (धुंध या स्प्रे) के साथ साइट कीटाणुरहित और एक शल्य चिकित्सा क्षेत्र के साथ पशु कवर.
- माउस के निष्फल त्वचा में एक छोटा सा चीरा, और ध्यान को बेनकाब त्वचा का प्रसारअंतर्निहित खोपड़ी. खोपड़ी की सतह सूखी. करोटि और शून्य निर्देशांक के रूप में midline का उपयोग करने के लिए (एपी) anterio पीछे और Medio पार्श्व (एमएल) stereotaxic निर्देशांक सेट, क्रमशः.
- उपयुक्त निर्देशांक प्रत्येक गोलार्द्ध पर खोपड़ी में एक छोटा सा छेद ड्रिल. अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचें. ध्यान ड्रिल तक ही हड्डी का उल्लंघन किया गया है. छेद साफ और dorso उदर मस्तिष्क की सतह पर (डीवी) stereotaxic निर्देशांक के लिए शून्य निर्देशांक निर्धारित. हम समन्वय के बाद का उपयोग करें (मिमी) SVZ या वयस्क के RMS (22-24 छ) C57BL / 6 चूहों में इंजेक्शन के लिए: SVZ के लिए: एपी 0.70, 1.20 एमएल और 1.90 DV, आरएमएस के लिए: एपी 2.55, 0.82 एमएल और DV 3.15.
- धीरे धीरे गाइड के रूप में उपयुक्त DV निर्देशांक का उपयोग कर मस्तिष्क में कांच micropipette टिप डालें, और धीरे धीरे एक छोटी राशि (हम 5 में 100-500 nl इंजेक्षन nl / सेक) इंजेक्षन सेल निलंबन (रिपोर्टर चूहों के SVZ से अलग) या एक वायरल कणों युक्त समाधान. हम आम तौर पर इस्तेमालlentiviral या रेट्रोवायरल कणों 1x10 6-1x10 8 / TU मिली.
- धीरे धीरे गिलास micropipette वापस लेने, खोपड़ी पर त्वचा सिवनी, और तेजी से वसूली के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस जगह. जब माउस सर्जरी के बाद जाग, एक एनाल्जेसिक (ketaprofen 10 मिलीग्राम / किलो, अनुसूचित जाति, 3 दिन बाद सेशन के दौरान प्रति दिन 1 इंजेक्शन). प्रशासन
2. तीव्र स्लाइस की तैयारी
- एक) एक कृत्रिम द्रव Cerebro रीढ़ की हड्डी (ACSF) sucrose आधारित समाधान चलकर काटने समाधान, जहां NaCl sucrose द्वारा प्रतिस्थापित टुकड़ा तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान वृद्धि हुई neuronal excitability गीला हो जाना है के रूप में करने के लिए भेजा है, निम्नलिखित हैं: समाधान करने के लिए तीव्र स्लाइस तैयार आवश्यक हैं और ख) NaCl युक्त ACSF, 32 डिग्री सेल्सियस एक पानी स्नान, जिस में स्लाइस स्थानांतरित कर रहे हैं और इमेजिंग तक बनाए रखा में गरम.
- काटने का समाधान: 210.3 sucrose, 3 KCI, 1.3 MgCI है 2 x6H 2 हे, 2 2 सी ए सी आई समाधान (मिमी) निम्नलिखित शामिल 2 26 3 NaHCO, 1.25 नाह 2 4 पीओ, 20 ग्लूकोज; ACSF: 125 NaCI, 3 KCI, 1.3 MgCI है 2 x6H 2 हे, 2 सी ए सी आई है 2 x2H 2 हे, 26 3 NaHCO, 1.25 2 नाह पीओ 4, 20 ग्लूकोज. 7.3-7.4 की एक pH पर समाधान को बनाए रखने, और उन्हें 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती द्वारा लगातार आक्सीजन के साथ मिलना.
- Ketamine / xylazine की intraperitoneal प्रशासन के साथ माउस anesthetize. एक जेली की तरह तरल नाइट्रोजन का उपयोग उपस्थिति के साथ ठंडा काटने समाधान तैयार. यह एक 20-सीसी सिरिंज का उपयोग कर समाधान के साथ माउस intracardiacaly छिड़कना.
- यह प्रक्रिया जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए, आमतौर पर समाधान के 20 मिलीलीटर के लिए 1-2 मिनट. यदि रक्त वाहिकाओं को काटने के समाधान के साथ perfusing के बजाय लेबल किया जाना चाहिए, दिल के बाएं वेंट्रिकल में transcardiacally Dextran टेक्सास रेड (10 मिग्रा / मिली) के 200 μl इंजेक्षन और माउस decapitating से पहले 2-3 मिनट तक इंतजार कर सकते हैं.
- मीटर सिर काटनाouse, और तेजी से ठंडा काटने समाधान में सिर विसर्जित कर दिया. कैंची का उपयोग करने खोपड़ी हटाने, और मध्य sagital सेरिबैलम से ओबी के लिए सीवन के साथ पूर्वकाल अक्ष के लिए पीछे से खोपड़ी में कटौती. धीरे फ्लैप कपाल संदंश का उपयोग कर हटा दें.
- आबकारी एक स्केलपेल का उपयोग कर मस्तिष्क की दुम का हिस्सा है. Intrahemispheric विदर साथ मस्तिष्क कट, और प्रत्येक गोलार्द्ध (चित्रा 1 ए) के सबसे पार्श्व भाग पर दो बाण के समान कटौती करने के. धीरे से एक रंग का उपयोग कर मस्तिष्क को हटाने, और बर्फ के ठंडे काटने समाधान में जगह.
- दो गोलार्द्धों अलग जगह पृष्ठीय अगर पक्ष को छू के साथ एक 4% अगर ब्लॉक, और दो गोलार्द्धों साथ एक vibratome के मंच के लिए ब्लॉक गोंद. गोंद laterally मंच गोलार्द्ध के पक्ष में कटौती, औसत दर्जे का पक्ष का सामना करना पड़ रहा है (चित्रा 1B) रखने. Vibratome के चैम्बर में मंच प्लेस और समाधान काटने के साथ इसे भरने. Sli भर oxygenated समाधान रखेंयह 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती द्वारा CE तैयारी.
- 250 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों vibratome का उपयोग कर तैयार है. हम एक microM एचएम 650 वी vibratome (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग करें और 100 हर्ट्ज और 1 मिमी / सेकंड की एक गति की एक आवृत्ति पर स्लाइस में कटौती. एक कम काटने गति और उच्च आवृत्ति ब्लेड कंपन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. के रूप में जल्द ही के रूप में एक टुकड़ा ब्लेड से जारी है, धीरे इसे काटने के समाधान से दूर करने के लिए और यह एक ऊष्मायन oxygenated 32 डिग्री पर एक पानी स्नान (चित्रा 1C) सी में बनाए रखा ACSF के साथ भरा कक्ष में जगह.
इस प्रक्रिया के रूप में जल्दी संभव प्रदर्शन सबसे अच्छी गुणवत्ता स्लाइस सुनिश्चित किया जाना चाहिए.
3. Neuroblast प्रवास के समय चूक इमेजिंग
पलायन neuroblasts की इमेजिंग neuroblasts लेबलिंग के बाद स्लाइस की तैयारी के 6-8 घंटे और 3-10 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए. प्रवास के मानकों में परिवर्तन से बचनेक्योंकि stereotaxic इंजेक्शन है कि मस्तिष्क क्षति और glial सक्रियण इस्तेमाल पतली इत्तला दे दी कांच microelectrodes (1-2 सुक्ष्ममापी) प्रेरित मस्तिष्क क्षति को कम करने के लिए, हो सकता है और इंजेक्शन की साइट से बाहर क्षेत्रों में इमेजिंग (RMS निम्नलिखित में यानी छवि प्रदर्शन SVZ में इंजेक्शन या घ्राण बल्ब के आरएमएस में आरएमएस में इंजेक्शन के बाद). हालांकि 21 दिनों के लिए इमेजिंग कर सकते हैं SVZ में lentiviral कणों के इंजेक्शन के बाद किया है, हम छोटे अंतराल के बाद इंजेक्शन (3-10 दिन) की सिफारिश के बाद से यह visualizing और देखने के प्रति अधिक क्षेत्र कोशिकाओं पर नज़र रखने की अनुमति देता है.
हम एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट मोटर चालित BX61WI (ओलिंप) खुर्दबीन सीसीडी (CoolSnapHQ2, Photometrics) कैमरा और 0.8 संख्यात्मक एपर्चर (ओलिंप) के साथ एक 40X पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ सुसज्जित इस्तेमाल किया. उच्च एनए के साथ उद्देश्यों बेहतर संकल्प छवियों को प्रदान करेगा. लेबल्ड neuroblasts उत्साहित थे (या तो एक संवाददाता दाता माउस से या virally लेबल grafted)एक महानिदेशक-4 Lambda 30-100 मिसे z प्रति अधिग्रहण के लिए 175 डब्ल्यू क्सीनन दीपक (Sutter उपकरण) के साथ सुसज्जित के साथ. मल्टी तरंगदैर्ध्य इमेजिंग भी उपयुक्त फिल्टर सेट (chroma) का उपयोग करने के लिए RMS के अन्य सेलुलर fluorescently लेबल astrocytes या रक्त वाहिकाओं जैसे तत्वों के साथ neuronal प्रवास को ट्रैक किया जा सकता. माइक्रोस्कोप, सीसीडी कैमरा और महानिदेशक 4 Metamorph (आण्विक डिवाइस) सॉफ्टवेयर है कि समय चूक अधिग्रहण कार्यक्रम के विभिन्न पैरामीटर सेट (देखें नीचे) की अनुमति के द्वारा नियंत्रित किया गया. स्लाइस एक PH1 सीरीज 20 अल्ट्रा चुप इमेजिंग (हार्वर्ड उपकरण) कक्ष खुर्दबीन पर निर्मित करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. चैम्बर एक स्वचालित हीटिंग सिस्टम (टीसी 344B, हार्वर्ड उपकरण) से जुड़ा था और लगातार oxygenated ACSF (चित्रा 1D) के साथ perfused था. कक्ष में तापमान 31-33 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था, और ACSF के प्रवाह की दर प्रति मिनट 1-2 मिलीलीटर था.
- माइक्रोस्कोप के इमेजिंग कक्ष में सावधानी टुकड़ा जगह. सेइमेजिंग के दौरान टुकड़ा की बहती से बचने के लिए, यह ध्यान टुकड़ा के शीर्ष पर एक नायलॉन जाल (वार्नर उपकरण) रखने से स्थिर है. जाल में 0.12 मिमी मोटी और 0.3 से 1.13 मिमी के उद्घाटन रेंज है. जाल स्थिति इतना है कि यह इमेजिंग क्षेत्र (चित्रा 1D) बाधा नहीं. एक 10X उद्देश्य का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र है, और फिर 40X उद्देश्य संलग्न और ध्यान समायोजित.
- यकीन है कि टुकड़ा लगातार ACSF साथ और उद्देश्य और टुकड़ा के बीच पर्याप्त समाधान है कि perfused है. ACSF छिड़काव, अनियमित छिड़काव, या कठोर तापमान बहती का कारण बनता है और इमेजिंग के दौरान फोकल हवाई जहाज़ में परिवर्तन विविधताओं की दर में परिवर्तन.
- समय चूक अधिग्रहण (यानी उत्तेजना की अवधि, z विमानों की संख्या, प्रत्येक z अनुभाग के बीच की दूरी, समय अंतराल, और रिकॉर्डिंग की अवधि) पैरामीटर Metamorph सॉफ्टवेयर, जो अधिग्रहण प्रणाली नियंत्रण का उपयोग कर सेट और समय शुरू अधिग्रहण चूक. दाटा स्वचालित रूप से एक एक अर्जित वीडियो समय चूक के समय बात करने के लिए इसी फ़ाइल के साथ झगड़ा फ़ाइलों के रूप में Metamorph द्वारा बचाया.
- कम से कम 1-2 घंटे के लिए इमेजिंग प्रदर्शन और विचार प्रवासी चरणों कि दो स्थिर चरणों द्वारा बाधित कर रहे हैं में ले लो. इमेजिंग के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है neuroblasts के प्रवास गुणों में किसी भी परिवर्तन के बिना 4 घंटा (हम अधिक से अधिक 4 घंटा स्थायी इमेजिंग सत्र प्रदर्शन नहीं किया था). टुकड़ा की सतह पर नहीं छवि कोशिकाओं करो. हम आम तौर पर 20 से 100 सुक्ष्ममापी की गहराई पर छवि. करने के लिए मज़बूती से और स्थिर और प्रवास चरणों की शुरुआत के अंत का निर्धारण - हम कम अधिग्रहण अंतराल (30 सेकंड 15) का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
- Neuronal व्यापारियों के प्रवास में विशिष्ट आणविक कारकों की भागीदारी का आकलन करने के लिए, सामान्य ACSF ACSF किसी भी वांछित औषधीय एजेंट (यानी, विभिन्न agonists, गरम, ब्लॉकर्स, वृद्धि कारक, आदि) युक्त प्रतिस्थापित किया जा सकता है. कम से कम के लिए इमेजिंग प्रदर्शननियंत्रण हालत में 1 घंटा और फिर औषधीय एजेंट की उपस्थिति में 1 घंटे के लिए.
4. Neuroblast माइग्रेशन का विश्लेषण
हम Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane) का उपयोग करने के लिए डेटा का विश्लेषण. यह हमें स्वचालित रूप से 3 डी में नवजात सेल प्रवास को ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है. Imaris 7.0F1 पैकेज MeasurementsPro, Imaris ट्रैकिंग ImarisColoc, ImarisXT, रेशा अनुरेखक, और InPress मॉड्यूल शामिल हैं.
- Imaris में फिल्म खुला, बस खींचने और कार्यक्रम आइकन पर वीडियो की पहली बार बिंदु की छवि छोड़ने द्वारा अधिग्रहीत छवियों (झगड़ा फ़ाइलें) लोड.
- एक बार फिल्म भरी हुई है, और प्रदर्शन समायोजन विंडो में संकेत की चमक, इसके विपरीत समायोजित करने के लिए, और छवि गुणों में हासिल कर ली वीडियो (voxel आकार और समय अंतराल) के मापदंडों सेट और समदूरस्थ समय अंक खिड़कियां (4A छवि) सेट . Voxel आकार निर्दिष्ट करने के बाद, यह संभव है कि 3 डी में फ्रेम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और समय के पैमाने पर देखेंवीडियो.
- स्वचालित रूप से दर्ज की कोशिकाओं ट्रैक, विंडो पार में स्पॉट समारोह चुनकर क्षेत्र में प्रत्येक कक्ष के लिए एक जगह बनाने के लिए. चरणों का पालन करें, और imaged वस्तुओं (4B चित्रा) पर आधारित पैरामीटर सेट. मानकों में से एक है कि स्लाइस विंडो में मापा जा सकता है सेल का व्यास है.
- समय पर पता लगाया वस्तुओं की विश्वसनीयता का निरीक्षण किया. यदि सब कुछ पलायन कोशिकाओं का पता नहीं कर रहे हैं, पता लगाने की दहलीज (4B चित्रा) बदलने के लिए, और यह सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को हर समय अंक पर धब्बों के साथ चयनित किया गया है.
- स्वचालित ट्रैकिंग के दौरान, अगर पड़ोसी समय अंक से दो वस्तुओं अपनी सीमाओं / किनारों के बीच किसी भी ओवरलैप है, एक ट्रैक कनेक्शन प्रत्येक ओवरलैप लिए बनाया जाएगा. अधिकतम दूरी और दो स्पॉट के बीच एक ही ट्रैक के पड़ोसी समय अंक का प्रतिनिधित्व अधिकतम अंतराल के आकार (चित्रा 4C) निर्दिष्ट किया जा सकता है कि कार्यक्रम के समय poin कनेक्ट कर सकते हैंटीएस. अधिकतम दूरी समय अंक की बाद में एक ही वस्तु के बीच की दूरी के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- एक बार पटरियों बना रहे हैं, यह संभव है कि पटरियों फिल्टर और बस उन्हें (चित्रा 4C) को हटाने के द्वारा अप्रासंगिक पटरियों को दूर. पटरियों को जोड़ने और रखती अलग पटरियों और एक ही ट्रैक के अलग अलग समय बिंदुओं (चित्रा 4C) द्वारा सुधारा जा सकता है.
- एक बार सभी सुधार किया गया है, पटरियों पर एक अंतिम नज़र रखना और एक Excel फ़ाइल (चित्रा 4D) डेटा (समय बिंदु प्रति सेल विस्थापन, ट्रैक की लंबाई, विस्थापन लंबाई, ट्रैक अवधि आदि) का निर्यात.
5. प्रतिनिधि परिणाम
हम परीक्षण किया है और व्यापक क्षेत्र neuroblast प्रवास के इमेजिंग समय चूक अनुकूलित. वायरल लेबलिंग या पलायन कोशिकाओं में मजबूत GFP अभिव्यक्ति (2 चित्रा) के लिए अनुमति दी SVZ में fluorescently लेबल neuroblasts की ग्राफ्टिंग. मल्टी तरंगदैर्ध्य इमेजिंग ख कर सकते हैंई dextran TexasRed भरा रक्त 4 वाहिकाओं (3 चित्रा और मूवी 1), fluorescently glial सेल विशिष्ट प्रमोटर (चित्रा 2B) 12 के साथ वायरस के stereotaxic इंजेक्शन द्वारा लेबल astrocytes के रूप में आरएमएस के अन्य सेलुलर तत्वों के साथ neuroblast प्रवास कल्पना करने के लिए आवेदन किया है, या विशेष रूप से ट्रांसजेनिक जानवर में astrocytes लेबल.
Neuronal सेल शरीर के प्रमुख एक स्थिर चरण से अलग प्रक्रिया की ओर विस्थापन (3 चित्रा, 1 सिनेमा और 2): व्यापक क्षेत्र तीव्र स्लाइस में neuroblast प्रवास के वीडियो इमेजिंग neuronal दो अलग चरणों से बना व्यापारियों के पलायन के ऊबड़ - खाबड़ व्यवहार का पता चला . पहचान और मज़बूती से स्थिर और प्रवासी चरण की अवधि के लिए विस्थापन की दर (प्रवास चरणों के दौरान ही की गणना) के रूप में अन्य सेल प्रवास पैरामीटर प्राप्त करने के लिए, इमेजिंग 3 डी में प्रदर्शन किया गया था एक कम अधिग्रहण अंतराल (एक बार 15 प्रति का उपयोग या 30 सेकंड). स्थिर और प्रवास के चरणों की durations की सटीक पहचान डेटा की स्पष्ट व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, एक निश्चित समय अवधि के दौरान प्रवास की दूरी में मतभेद प्रवास की दर में परिवर्तन के द्वारा या माइग्रेशन और स्थिर चरणों की अवधि या आवधिकता में संशोधनों के द्वारा या तो प्रेरित कर सकते हैं. लंबे अधिग्रहण अंतराल का उपयोग इन विभिन्न संभावनाओं प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है.
Imaris सॉफ्टवेयर 3 डी में neuroblasts के प्रवास को विश्लेषण और ट्रैक अवधि और ट्रैक की लंबाई, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्रैक विस्थापन लंबाई, जो विस्थापन का एक वेक्टर के रूप में सेल प्रवास के अतिरिक्त पैरामीटर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ट्रैक straightness भी ट्रैक विस्थापन लंबाई से ट्रैक की लंबाई विभाजित करके गणना की जा सकता है और यह व्यक्ति neuroblast के पलायन मार्ग के straightness इंगित करता है.
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चित्रा 1. तीव्र जीना स्लाइस की तैयारी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ए) एक दुम का, एक और दो intrahemispheric बाण के समान कटौती की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. बी) अगर और vibratome के ब्लॉक मंच पर माउस मस्तिष्क रखने के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. सी) तीव्र टुकड़ा ऊष्मायन कक्ष के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. डी) इमेजिंग ईमानदार माइक्रोस्कोप बनाया चैम्बर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.
चित्रा 2. RMS में neuroblasts के) कम बढ़ाई मजबूत neuroblasts और वयस्क आरएमएस में रक्त वाहिकाओं की लेबलिंग दिखा छवि लेबल. एक retrovirus एन्कोडिंग GFP SVZ में इंजेक्ट किया गया था, और GFP-व्यक्त कोशिकाओं (हरा) आरएमएस में 3 दिन (बाएं पैनल) के बाद पाया गया है. रक्त वाहिकाओं इंजेक्शन लगाने, dextran माउस (लाल, सही पैनल) के दिल में TexasRed द्वारा लेबल थे. इनसेट एक उच्च magnific से पता चलता हैरक्त वाहिकाओं और रक्त वाहिकाओं के साथ जुड़े virally लेबल neuroblasts समझना छवि. बी) वयस्क आरएमएस में अलग सेलुलर तत्वों की लेबलिंग. Neuroblasts SVZ (लाल) में mCherry एन्कोडिंग lentivirus इंजेक्शन द्वारा चिह्नित किया गया है, astrocytes GFAP प्रमोटर के RMS (हरा) में नियंत्रण के अधीन एक lentivirus एन्कोडिंग GFP इंजेक्शन द्वारा लेबल थे, और रक्त वाहिकाओं Dextran CascadeBlue (नीले इंजेक्शन द्वारा लेबल थे ) दिल में. सी) एक वयस्क चूहे जंगली प्रकार के SVZ में एक माउस GAD67 GFP SVZ से GAD67 - GFP dissociated कोशिकाओं के इंजेक्शन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. डी) प्रतिरोपित GAD67 GFP कोशिकाओं (हरा) RMS 7 दिनों में SVZ में कलम बांधने का काम करने के बाद पता चला. आरएमएस GFAP (नीला) के साथ immunostained है. ई) प्रतिरोपित GAD67 GFP कोशिकाओं (हरा) DCX (लाल) के लिए immunopositive थे, लेकिन GFAP (नीला) के लिए immunonegative थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. रक्त वाहिकाओं के साथ समय चूक neuroblasts की इमेजिंग neuroblast की. समय चूक इमेजिंग (हरा) प्रवास (लाल). तीर neuroblasts के प्रवास चरणों से संकेत मिलता है, और arrowheads स्थिर चरणों से संकेत मिलता है.
चित्रा 4. Neuroblast प्रवास का विश्लेषण (ई.) neuroblasts प्रवास विश्लेषण के विभिन्न चरणों. लाल हलकों अलग पाठ में उल्लेख किया कार्यों से संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Virally लेबल neuroblasts की 1 वीडियो समय चूक इमेजिंग (हरा) dextran साथ पलायन लेबल रक्त वाहिकाओं (लाल). TexasRed सीयहाँ चाटना वीडियो देखने के लिए.
2 वीडियो Imaris सॉफ्टवेयर द्वारा neuroblast प्रवास ट्रैकिंग. ग्रीन डॉट्स सेल शरीर से संकेत मिलता है और पटरियों प्रवास की दूरी से संकेत मिलता है. वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
neuronal व्यापारियों की सही लक्ष्यीकरण उपयुक्त मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एक मौलिक उचित और तंत्रिका circuitry के विधानसभा समारोह अंतर्निहित प्रक्रिया है. कोशिकाओं के विशाल बहुमत भ्रूण विकास के दौरान विस्थापित और ओ, दांतेदार गाइरस और सेरिबैलम जैसे कुछ क्षेत्रों में ही प्रसव के बाद मस्तिष्क में neuronal विस्थापन अभी भी जगह लेता है. प्रसव के बाद मस्तिष्क में सेल प्रवास orchestrating तंत्र बने हुए हैं, लेकिन खराब समझ. परिपक्व तंत्रिका ऊतकों में सेल प्रवास मार्गदर्शन में शामिल तंत्र और आणविक मार्ग का ज्ञान प्रसव के बाद मस्तिष्क में neuronal लक्ष्यीकरण के बारे में हमारी समझ में सुधार और नई रणनीति के विकास के लिए नैदानिक प्रासंगिकता मस्तिष्क के रोगग्रस्त क्षेत्रों में neuronal भर्ती उत्पन्न हो सकता है.
इस पांडुलिपि में, हम निगरानी वयस्क माउस अग्रमस्तिष्क के तीव्र स्लाइस में सेल प्रवास के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. जब तक हम वयस्क SVZ ओबी का इस्तेमाल कियामार्ग एक मॉडल प्रणाली के रूप में, एक ही तकनीक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क मस्तिष्क चोट के बाद में भ्रूण और जल्दी प्रसवोत्तर दिमाग में सेल प्रवास का पालन करने के लिए लागू किया जा सकता है. हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करने के लिए जल्दी प्रसवोत्तर RMS 12, सेरिबैलम और वयस्क स्ट्रिएटम बाद स्ट्रोक (Eiriz, ग्रेड, मालवा और Saghatelyan, अप्रकाशित डेटा) में सेल प्रवास का पालन.
Neuroblast प्रवास के इमेजिंग तीव्र रहते हैं स्लाइस कि सेल प्रवास एक microenvironment कि निकट vivo परिस्थितियों में mimics में अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं उपयोग किया गया था. पलायन कोशिकाओं या तो वायरल कणों के stereotaxic इंजेक्शन द्वारा या संवाददाता चूहों से जंगली प्रकार चूहों के SVZ में neuroblasts ग्राफ्टिंग द्वारा visualized रहे थे. प्रवास विश्लेषण इंजेक्शन साइट से दूर किया गया था. आरएमएस में स्पर्शरेखा प्रवास का अध्ययन करने के लिए, हम neuroblasts थे लेबल के बाद 3-5 दिनों तीव्र स्लाइस तैयार. ओबी में रेडियल प्रवास का अध्ययन, स्लाइस काएं 7-10 दिनों के बाद तैयार किया गयाSVZ में reotaxic इंजेक्शन. वयस्क SVZ भी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में neuronal व्यापारियों के वायरल लक्ष्यीकरण और विशिष्ट आणविक संकेत upregulating या downregulating माइग्रेशन प्रक्रिया में शामिल कारकों मिलाना. यह भी संभव है आरएमएस में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं लेबल और बहु तरंगदैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन खोया सामानघर ट्रेसर भरे 4 रक्त वाहिकाओं, 13 या साथ virally या आनुवंशिक लेबल astrocytes 2, 12 के साथ neuroblasts प्रवास के पैटर्न को सुलझाना.
छवि neuroblast प्रवास करने के लिए हम एक motorized प्रतिदीप्ति ईमानदार एक सीसीडी कैमरा है कि उत्तेजना प्रकाश दालों की कमी (30-100msec) के बाद विभिन्न z विमानों पर अपेक्षाकृत तेजी से अधिग्रहण की अनुमति दी साथ सुसज्जित खुर्दबीन इस्तेमाल किया. इस photobleaching रोका और neuroblast प्रवास के 3 डी दृश्य के साथ दखल के बिना दो बाद अधिग्रहण के बीच समय अंतराल को कम. अन्य समूहों confocal या दो photon सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल किया है सेल migr की निगरानीप्रसवोत्तर RMS 14-16 में समझना. दोनों तकनीकों के अपने फायदे और सीमाओं, जो मुख्य रूप से लौकिक और स्थानिक संकल्प मुद्दों से संबंधित हैं. हम लगातार अधिग्रहण के बीच कम अंतराल (15-30 सेकंड) का उपयोग करने की सलाह देते हैं. नवजात न्यूरॉन्स नाचनेवाला व्यवहार किया है, और प्रवास चरणों स्थिर समय है कि अप्रैल 04-10 मिनट के रूप में संक्षिप्त हो सकता है के द्वारा बाधित कर रहे हैं. इस प्रकार का प्रवास को देखते हुए, यह लगातार समय बिंदुओं के बीच अपेक्षाकृत तेजी से अधिग्रहण अंतराल (15-30 सेकंड) का उपयोग करने के लिए मज़बूती से और माइग्रेशन और स्थिर चरणों की शुरुआत और अंत की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह मुश्किल है को प्राप्त करने के लिए जब लगातार दो अधिग्रहण के बीच समय अंतराल में कई मिनट के रेंज में है. स्थिर और प्रवास के चरणों की एक सटीक निर्धारण असंदिग्ध रूप से, जो प्रवास 4 चरणों, 17 के दौरान केवल मात्रा निर्धारित करना चाहिए neuroblast प्रवास की गति को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है. लंबी अधिग्रहण अंतराल averag की गणना करने की अनुमति देता हैदूरी के रूप में ई की गति समय की एक निश्चित अवधि है कि स्थिर चरणों शामिल पर कूच. इस विधि द्वारा निर्धारित औसत गति में परिवर्तन, तथापि, प्रवास की दर में अंतर (प्रवास चरणों के दौरान ही परिभाषित) या स्थिर और प्रवास चरणों की अवधि के द्वारा भी कारण कर सकते हैं. अधिग्रहण के मानकों में इन मतभेदों neuroblasts प्रवास विभिन्न समूहों द्वारा रिपोर्ट की गति में विसंगतियों आबाद होने की संभावना हैं. एक 15-30 सेकंड अंतराल के साथ तेजी से अधिग्रहण प्रदर्शन और प्रवास चरणों के दौरान विशेष रूप से प्रवास की दर का निर्धारण करने, हम 120-150 सुक्ष्ममापी / 4 घंटे, 12 के प्रवास के एक गति की गणना, जबकि अन्य समूहों, जो एक अधिग्रहण के अंतराल का उपयोग 3-7 मिनट 50-100 सुक्ष्ममापी / 14 घंटे, 15, 18 के एक गति की सूचना दी. सीसीडी कैमरों के साथ व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट इमेजिंग के मुख्य दोष यह है कि स्कैनिंग प्रणालियों की तुलना में कम स्थानिक संकल्प प्रदान करता है. हालांकि, बाद से ओर पलायन neuroblasts एक कॉम्पैक्ट Morpसोमा और कम प्रमुख प्रक्रियाओं के साथ hology, एक कम स्थानिक संकल्प सेल शरीर के स्तर पर विश्वसनीय और neuroblasts की पहचान ट्रैकिंग नहीं रोकता नहीं और भी प्रमुख प्रक्रियाओं (3 चित्रा और वीडियो 1 और 2).
तकनीक हम यहाँ का वर्णन एक बारीकी से विश्लेषण किया जा vivo शर्तों में नकल उतार microenvironment में neuroblast प्रवास, आरएमएस के विभिन्न घटकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है, और इन मुलाकातों neuroblast प्रवास में की भूमिका की जांच की जा है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान (CIHR) की एक कनाडाई ASJK आंशिक रूप से एक Université Laval फैलोशिप द्वारा समर्थित संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया. के रूप प्रसवोत्तर neurogenesis में एक कनाडा अनुसंधान चेयर के प्राप्तकर्ता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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