Summary
We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.
Abstract
Er is een groot aantal cijfers blijkt dat aangeeft dat nieuwe functionele neuronen constitutief zijn gegenereerd op basis van een endogene pool van neurale stamcellen in beperkte gebieden van de volwassen hersenen van zoogdieren. Pasgeboren neuroblasten van de subventriculaire zone (SVZ) migreren langs de rostrale migratie stroom (RMS) naar hun eindbestemming in de bulbus olfactorius (OB) 1. In de RMS, neuroblasten tangentiaal migreren in ketens ensheathed door astrocytische processen met 2,3 bloedvaten als structurele steun en een bron van moleculaire factoren vereist voor migratie 4,5. In de OB, neuroblasten los van de ketens en migreren radiaal in de verschillende bulbaire lagen er te differentiëren in interneuronen en te integreren in het bestaande netwerk 1, 6.
In dit manuscript beschrijven we de procedure voor toezicht celmigratie in acute plakken van het knaagdier hersenen. Het gebruik van acute segmenten kan de assessment van celmigratie in de micro-omgeving die nauw lijken op in vivo omstandigheden en in hersengebieden die moeilijk toegankelijk zijn voor in vivo imaging. Bovendien voorkomt lange kweken voorwaarde bij organotypische en celkweken die uiteindelijk kunnen veranderen de migratie-eigenschappen van de cellen. Neuronale voorlopers in acute plakjes kan worden gevisualiseerd met behulp van DIC optiek of fluorescerende eiwitten. Virale labeling van neuronale precursors in de SVZ, neuroblasten enten van reporter muizen in de SVZ van wild-type muizen, en transgene muizen die fluorescent eiwit expressie in neuroblasten zijn geschikte werkwijzen voor het visualiseren neuroblasten en na de migratie. De latere methode echter geen afzonderlijke cellen worden bijgehouden voor lange tijd vanwege de hoge dichtheid van gemerkte cellen. We gebruikten een breed gebied fluorescent rechtop microscoop uitgerust met een CCD camera om een relatief snelle acquisitie interval (een ima verwezenlijkenge elke 15 of 30 sec) om betrouwbaar identificeren stationaire fasen en migratie. Een exacte beschrijving van de duur van de stationaire en trekkende fasen is cruciaal voor de eenduidige interpretatie van de resultaten. We hebben ook uitgevoerd meerdere z-stap overnames om neuroblasten migratie in 3D te volgen. Wide-field fluorescerende beeldvorming is uitgebreid gebruikt om neuronale migratie visualiseren 7-10. We beschrijven gedetailleerd protocol voor het labelen neuroblasten, uitvoeren real-time video-imaging van neuroblast migratie acute plakken van de volwassen muis voorhersenen en analyseren celmigratie. Hoewel de beschreven protocol voorbeeld de migratie van neuroblasten in de volwassen RMS kan ook worden gebruikt om celmigratie volgen embryonale en vroege postnatale hersenen.
Protocol
1. Labeling Neuronale Voorlopers
Neuroblasten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van transgene muizen die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in neuroblasten (dwz Dcx-GFP, Gad67-GFP), door stereotaxically injecteren virale deeltjes codeert fluorescerende eiwitten in de SVZ of RMS of door het enten van neuronale precursors reporter muizen (dwz , Dcx-GFP, Gad67-GFP) in de SVZ van wild-type muizen. We beschrijven de procedure voor het enten en virale etikettering van neuronale precursoren.
Dissociatie van neuroblasten het SVZ van muizen reporter
- De volgende oplossingen zijn nodig voor neuroblast dissociatie.
40X oplossing
10 ml Pen / strept (Stock Pen 10.000 E / ml / strept 1000 ug / ml)
10 ml Glucose (Stock 200 mg / ml)
20 ml Natriumpyruvaat (100 mM voorraad)
ove_content "> 10 ml H 2 OBereid 1 ml aliquots
Dissection oplossing (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X oplossing - 2,5 ml
DNase oplossing (20K eenheden / ml)
DNasel, typeIV van runderen alvleesklier
150.000 eenheden oplossen in 7,5 ml H 2 O
0,22 um gefilterd
Bereid 1 ml aliquots
Trypsine-DNasel oplossing (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNasel (20K eenheden / ml) - 0,15 ml
Trypsine-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X oplossing - 0,25 ml
Trituratie oplossing (50 ml)
ntent "> Neurobasal medium - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 pi
40X oplossing - 1,25 ml
DNasel (20K eenheden / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize twee tot drie maanden oude volwassen muis expressie een fluorescerend eiwit in neuroblasten met een intraperitoneale injectie van 100 ul van ketamine / xylazine (10 mg / 1 mg per 10 g lichaamsgewicht) en onthoofden. Wij gebruiken GAD67-GFP muizen 11. Met de scalpel, coronally plak de hersenen op het niveau van de laterale ventrikel en ontleden de SVZ in ijskoude dissectie medium. Plaats de SVZ in een microcentrifuge buis met 500 ui trypsine-DNase oplossing en houdt op ijs gedurende 20 minuten.
- Breng de SVZ in een 15 ml conische buis met 5 ml voorverwarmde (37 ° C) trypsine-DNase oplossing en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Breng de gehele inhoud in een 50 ml conische buis met 15 ml tritfiguratie oplossing en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Zuig het supernatant, voeg 10 ml triturering oplossing in de cellen een nieuwe 15 ml conische buis en gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 1 minuut.
- Fire-lak een Pasteur pipet om de punt grootte en vacht verminderen met trituratie medium. Na centrifugatie verwijderd zoveel mogelijk de supernatant en voeg 2 ml verse fijnwrijving oplossing van het conische buis. Vermaal de cellen in de trituratie oplossing (ongeveer 50 keer op en neer met Pasteur pipet). Neem de bovenste helft van de supernatant, die goed gedissocieerde cellen bevat en breng deze in een nieuwe 15 ml conische buis met 10 ml van oplossing trituratie.
- Fire-polish een Pasteur pipet om verdere vermindering van de tip grootte. Voeg een 1 ml fijnwrijving oplossing voor de buis met de resterende ongedissocieerde cellen, blijven de fijnwrijven (ongeveer 10 keer op en neer), en breng de gehele inhoud van de 15 ml conische buis containing eerder gedissocieerde cellen. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 7 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de gepelleteerde cellen in 50 ml van neurobasal medium, lading in een telkamer en tel de cellen.
Graft het gewenste aantal cellen in de SVZ volgens de hieronder beschreven procedure.
Stereotactische injectie van het virus en enten van gedissocieerde cellen
- Steriliseer alle instrumenten met behulp van een kraal sterilisator voor aanvang van de operatie.
- Voor stereotaxische injecties, gebruikt glas micropipetten met zeer dunne tips (1-2 pm) tot hersenbeschadiging te minimaliseren. Om een pipet te maken, trek een glazen capillair met een pipet trekker. Backfill de pipet met paraffineolie tot half-vol, en steek de plunjer van een nanoliter injector (World precisie-instrumenten) in de onbehandelde einde van de pipet.
- Met behulp van een nanoliter injector controller, dwingen de olie naar beneden met het zuiger tot een kleine drop van paraffineolie extrudeert uit de dunne punt. Laat de pipet in een steriele houder met 0,5-1 ul van een oplossing die hetzij virale deeltjes (1x10 1x10 6-8 TU / ml) of gedissocieerde cellen SVZ. Gebruik het intrekken functie van de injector nanoliter de pipet te vullen met de gewenste oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipet.
- Anesthetize twee tot drie maanden oude volwassen C57Bl / 6 muis met een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine. Een elektrisch scheerapparaat op de chirurgische lokatie scheren op het hoofd. Reinig goed met natte gaas om alle aanhangend haar te verwijderen.
- Plaats de muis op een stereotactische frame en bevestig het hoofd. Was het haar-vrij injectieplaats met desinfecterende zeep (Hibitane) en daarna met 70% alcohol (gaas of spray). Desinfecteer de site met Proviodine (gaas of spray) en bedek het dier met een chirurgische veld.
- Maak een kleine incisie in de gesteriliseerde huid van de muis, en voorzichtig uit de huid bloot te leggende onderliggende schedel. Droog het oppervlak van de schedel. Gebruik de bregma en middellijn als de nul coördinaten aan de Voorwandinfarct-posterior (AP) en medio-laterale (ML) stereotaxische coördinaten in te stellen, respectievelijk.
- Boor een klein gaatje in de schedel over elk halfrond op de juiste coördinaten. Voorkom beschadiging van het onderliggende hersenweefsel. Boor voorzichtig totdat alleen het bot is geschonden. Reinig de opening en stel de nul coördinaten van de dorso-ventrale (DV) stereotactische coördinaten op het oppervlak van de hersenen. Wij hanteren de volgende coördinaat (in mm) voor injecties in de SVZ of RMS van volwassen (22-24 g) C57Bl / 6 muizen: voor SVZ: AP 0,70, ML 1,20 en 1,90 DV, want RMS: AP 2,55, ML 0,82 en DV 3.15.
- Langzaam steek de glazen micropipet tip in de hersenen met behulp van de juiste DV coördinaten als gidsen, en injecteer langzaam een kleine hoeveelheid (we 1-500 nl injecteren bij 5 nl / sec) van de celsuspensie (losgemaakt van de SVZ van reporter muizen) of een oplossing bevattende virale deeltjes. We gebruiken meestallentivirale of retrovirale deeltjes 1x10 1x10 6-8 TU / ml.
- Langzaam trekken de glazen micropipet, hechten de huid over de schedel, en plaats de muis op een verwarming pad voor een sneller herstel. Wanneer de muis wakker na de operatie toegediend, een analgeticum (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injectie per dag gedurende drie dagen na de operatie).
2. Voorbereiding Acute Slices
- De volgende oplossingen moeten acute plakjes bereiden: a) een kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) sucrose-oplossing, hierna snijden oplossing, waarbij NaCl vervangen door sucrose tot verhoogde neuronale prikkelbaarheid dempen tijdens de bereiding slice procedure, en b) ACSF met NaCl, verwarmd tot 32 ° C in een waterbad, waarin de plakken worden overgedragen en gehandhaafd tot beeldvorming.
- De oplossingen bevatten de volgende (in mm): snijden oplossing: 210,3 sucrose, 3 KCI, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 2 O 26 NaHCO3, 1,25 NaH 2PO 4, 20 glucose, ACSF: 125 NaCl, 3 KCI, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 x2H 2 O, 26 NaHCO3, 1,25 NaH 2PO 4, 20 glucose. Handhaaf de oplossingen bij een pH van 7.3-7.4, en voortdurend zuurstof door doorleiden ze met 95% O2 / 5% CO 2.
- Verdoven de muis met een intraperitoneale toediening van ketamine / xylazine. Bereid ijskoude snijden oplossing met een gelei-achtige uitstraling met behulp van vloeibare stikstof. Intracardiacaly perfuseren de muis met deze oplossing met een 20 cc spuit.
- Deze procedure moet snel worden uitgevoerd, meestal 1-2 min voor 20 ml oplossing. Als de bloedvaten te worden gelabeld, in plaats van perfusie met het uitsnijden oplossing injecteren transcardiacally 200 pi Dextran Texas Red (10 mg / ml) in de linker hartkamer en wacht 2-3 min voor onthoofden de muis.
- Onthoofden de mOuse, en snel dompel de kop in ijskoude snijden oplossing. Gebruik de schaar om de hoofdhuid verwijderen en de schedel van de posterior naar anterior as snijden langs de mid-sagittale hechting van het cerebellum van de OB. Verwijder voorzichtig de craniale flappen behulp van een tang.
- Accijnzen het caudale deel van de hersenen met behulp van een scalpel. Snijd de hersenen langs de intrahemispheric spleet, en zo twee sagittale sneden op de zijkant van elk halfrond (Figuur 1A). Verwijder voorzichtig de hersenen met behulp van een spatel, en plaats deze in ijskoud snijden oplossing.
- Afzonderlijk Plaats de twee hersenhelften op een 4% agar blok met de dorsale zijde aanraken van de agar, en lijm het blok met de twee hersenhelften om het platform van een vibratome. Lijm de zijdelings gesneden kant van de halve bol aan het platform, het houden van mediale zijde naar boven (Figuur 1B). Plaats het platform in de kamer van de vibratome en vul deze met het snijden oplossing. Bewaar de oplossing zuurstof in de slice voorbereiding door borrelen met 95% O2 / 5% CO 2.
- Bereid 250 pm dikke secties met behulp van de vibratome. We gebruiken een Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) en snijd de plakjes op een frequentie van 100 Hz en een snelheid van 1 mm / sec. Een laag snijsnelheid en hoogfrequente trillingen mes worden gebruikt om hoogwaardige secties verkrijgen. Zodra een segment wordt vrijgegeven van het mes voorzichtig verwijderen van de snij oplossing en plaats deze in een incubatiekamer gevuld met zuurstof ACSF op 32 ° C in een waterbad (Figuur 1C).
Deze procedure dient zo snel mogelijk de beste kwaliteit plakjes waarborgen.
3. Time-lapse imaging van neuroblast Migratie
De beeldvorming van migrerende neuroblasten moet worden uitgevoerd binnen 6-8 uur de voorbereiding van plakken en 3-10 dagen na neuroblasten labeling. Om veranderingen in de migratieparameters te voorkomenvanwege stereotaxische injectie die schade aan de hersenen en gliale activering gebruik dunne-tipped glas micro-elektroden (1-2 micrometer) kan veroorzaken aan de hersenen schade te minimaliseren, en het uitvoeren van de beeldvorming in de regio's distaal van de plaats van injectie (dwz beeld in de RMS volgende injectie in de SVZ of de RMS van bulbus olfactorius na injectie in de RMS). Hoewel de beeldvorming kan worden uitgevoerd tot 21 dagen na injectie van lentivirale deeltjes in de SVZ, raden korter na injectie interval (3-10 dagen), aangezien het visualiseren en volgen meer cellen per beeldveld.
We gebruikten een breed gebied fluorescent gemotoriseerde BX61WI microscoop (Olympus) uitgerust met een CCD camera (CoolSnapHQ2, Photometrics) en een 40x water immersie objectief met een numerieke apertuur 0,8 (Olympus). De doelstellingen met een hogere NA zal zorgen voor een betere resolutie. Labeled neuroblasten (geënt hetzij van een verslaggever donor muis of viraal label) waren enthousiasteen Lambda DG-4 uitgerust met een 175 W xenon lamp (Sutter Instruments) voor 30-100 msec per z acquisitie. Multi-golflengte beeldvorming kan ook worden uitgevoerd met geschikte filter sets (Chroma) aan neuronale migratie volgen langs de andere cellulaire elementen van de RMS, zoals fluorescent gelabelde astrocyten of bloedvaten. De microscoop, CCD-camera en DG-4 werden bestuurd door Metamorph software (Molecular Device) die manier konden de verschillende parameters van time-lapse acquisitie programma worden ingesteld (zie hieronder). De plakjes werden overgebracht naar een PH1 Series 20 ultrastille beeldkamer (Harvard Apparatus) gebaseerd op de microscoop. De kamer werd gekoppeld aan een automatische verwarmingssysteem (TC-344b, Harvard Apparatus) en werd continu doorstroomd met ACSF geoxygeneerde (Figuur 1D). De temperatuur in de kamer werd op 31-33 ° C en het debiet van de ACSF was 1-2 ml per min.
- Plaats de plak in de beeldvorming kamer van de microscoop. Naarvoorkomen afdrijven van slice imaging tijdens stabiliseren door voorzichtig plaatsen van een nylon mesh (Warner Instruments) bovenop de slice. Het gaas is 0,12 mm dik en de openingen bereik 0,3 tot 1,13 mm. Plaats het gaas zodat het niet belemmert het beeldveld (Figuur 1D). Gebruik een 10X objectief tot een gebied van belang te vinden, en schakel vervolgens de 40X objectief en scherp.
- Zorg ervoor dat de plak continu doorstroomd met ACSF en dat er voldoende oplossing tussen de doelstelling en de plak. Veranderingen in de snelheid van ACSF perfusie, onregelmatige perfusie, of drastische temperatuurschommelingen veroorzaakt drijven en veranderingen in het brandvlak tijdens de beeldvorming.
- De time-lapse opnameparameters (dwz door de excitatie, het aantal vlakken z, z afstand tussen elk profiel, tijdsinterval en opnameduur) met de Metamorph software, waarvan de verwerving systeem controleert en start de time- vervallen overname. Data wordt automatisch bewaard door Metamorph als tiff bestanden met elk bestand overeenkomt met een tijdstip van de overgenomen time-lapse video.
- Voer de beeldvorming ten minste 1-2 uur en houdt rekening trekkende fasen die worden onderbroken door twee stationaire fasen. De beeldvorming kan worden uitgevoerd voor maximaal 4 uur (we wisten niet uitvoeren beeldvorming sessies die langer dan 4 uur) zonder enige veranderingen in de migratie-eigenschappen van de neuroblasten. Niet image cellen aan het oppervlak van de plak. We meestal beeld op een diepte van 20 tot 100 urn. We raden korte acquisitie intervallen (15 - 30 sec) betrouwbaar te bepalen het begin en einde van de stationaire fase en migratie.
- Om de betrokkenheid van specifieke moleculaire factoren in de migratie van neuronale precursors evalueren, kunnen normale ACSF zijn gesubstitueerd met ACSF met elke gewenste farmacologisch middel (dwz verschillende agonisten, antagonisten blokkers, groeifactoren, enz.). Voer imaging minstens1 uur in controlegroep en daarna 1 uur in aanwezigheid van het farmacologische middel.
4. Het analyseren van neuroblast Migratie
Wij gebruiken Imaris software (bitvlak) om de gegevens te analyseren. Dit stelt ons in staat om automatisch te volgen pasgeboren celmigratie in 3D. De Imaris 7.0F1 pakket omvat de MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer, en Inpress modules.
- Om de film te openen in Imaris, laadt u de verkregen beelden (tiff-bestanden) door simpelweg te slepen en neer te zetten het beeld van de eerste keer dat punt van de video op het programma-icoon.
- Zodra de film is geladen, stelt u de helderheid en het contrast van het signaal in de aanpassing van de weergave-venster en stel de parameters van de verworven video (voxel grootte en tijdsinterval) in de afbeelding eigenschappen en instellen op gelijke afstand tijdstippen ramen (Fig. 4A) . Nadat u de voxelafmeting, is het mogelijk om geschikte frame in 3D als de tijd en de omvang van devideo.
- Om automatisch te volgen opgenomen cellen, een plek voor elke cel in het veld in de SURPASS-venster door te kiezen voor de Spots functie. Volg de stappen, en stel de parameters op basis van de afgebeelde objecten (Figuur 4B). Een van de parameters is de diameter van de cel die kan worden gemeten in de Slice venster.
- Controleer de betrouwbaarheid van de gedetecteerde objecten tijd. Als alle migrerende cellen worden niet automatisch gedetecteerd, verandert u de drempel van detectie (Figuur 4B), en zorg ervoor dat alle cellen zijn geselecteerd met vlekken op alle tijdstippen.
- Tijdens automatisch volgen, als twee naburige voorwerpen uit tijdstippen geen overlap tussen de grenzen / randen een railaansluiting gemaakt voor elke overlap. De maximale afstand en de maximale grootte van de opening (figuur 4C) tussen twee plaatsen die naburige tijdstippen van hetzelfde spoor moeten zo worden bepaald dat het programma kan de tijd poin aansluitents. De maximale afstand wordt bepaald door de afstand tussen hetzelfde object op latere tijdstippen.
- Nadat de tracks zijn gemaakt, is het mogelijk om de tracks filteren en irrelevante tracks verwijderen door eenvoudig verwijdert (Figuur 4C). Titels kan worden gecorrigeerd door koppelen en ontkoppelen verschillende sporen en verschillende tijdstippen van dezelfde track (Figuur 4C).
- Zodra alle correcties zijn aangebracht, neem een laatste blik op de sporen en de gegevens exporteren (cel verplaatsing per tijdstip, baanlengte, verplaatsingslengte, track duur enz.) naar een Excel-bestand (Figuur 4D).
5. Representatieve resultaten
We getest en geoptimaliseerd wide-field time-lapse imaging van neuroblast migratie. Virale etikettering of enten van fluorescent gemerkte neuroblasten in de SVZ toegestaan robuuste GFP expressie in migrerende cellen (Figuur 2). Multi-golflengte beeldvorming kan be toegepast neuroblast migratie visualiseren langs andere cellulaire elementen van de RMS zoals dextran TexasRed gevulde bloedvaten 4 (Figuur 3 en Film 1), astrocyten fluorescent gelabeld door stereotactische injectie van virussen met een gliacel promoter (Figuur 2B) 12, of specifiek gelabeld astrocyten in transgene dieren.
Breedveld video-imaging van neuroblast migratie in acute plakken onthulde de sprongsgewijze gedrag migreren neuronale precursors uit twee verschillende fasen: verplaatsing van de neuronale cel lichaam naar de leidende proces gescheiden door een stationaire fase (figuur 3 films 1 en 2) . Betrouwbaar de duur van de stationaire fase en trekkende identificeren en het afleiden van celmigratie andere parameters zoals de mate van verplaatsing (alleen berekend bij het migratiefasen) werd uitgevoerd in 3D beeldvorming met een korte acquisitie interval (eenmaal per 15 of 30 sec). De exacte beschrijving van de duur van de stationaire en migratie fasen is cruciaal voor de eenduidige interpretatie van gegevens. Zo kunnen verschillen in de afstand van migratie gedurende een bepaalde periode hetzij geïnduceerd door veranderingen in de snelheid van de migratie of door wijzigingen in de duur of frequentie van de migratie en stationaire fasen. Deze verschillende mogelijkheden niet te onderscheiden met lange intervallen verkrijgen.
Imaris software werd gebruikt om de migratie van neuroblasten in 3D analyseren en leiden extra parameters van celmigratie zoals Tijdsduur en baanlengte, evenals spoor verplaatsingslengte, een vector van verplaatsing. De baan rechtheid kan ook worden berekend door de baanlengte van de baan verplaatsingslengte en geeft de rechtheid van de migrerende route van individuele neuroblast.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van de bereiding van acute levende plakken. A) Schematische weergave van een staart, een intrahemispheric en twee sagittale sneden. B) Schematische weergave van het plaatsen van de muizenhersenen op agar blok en het platform vibratome. C) Schematische weergave van acute slice incubatiekamer. D) Schematische weergave van de imaging ruimte die aan de staander microscoop.
Figuur 2. Etikettering van neuroblasten in de RMS. A) Lage vergroting afbeelding met robuuste etikettering van neuroblasten en bloedvaten in de volwassen RMS. Een retrovirus dat codeert voor GFP werd geïnjecteerd in de SVZ en GFP tot expressie brengende cellen (groen) zijn in de RMS na 3 dagen (linker paneel). Bloedvaten werden bestempeld door het injecteren van dextran TexasRed in het hart van de muis (rood, rechter paneel). De inzet toont een hoge Magnificatie beeld van de bloedvaten en viraal gelabeld neuroblasten geassocieerd met bloedvaten. B) Labeling van verschillende cellulaire elementen in de volwassen RMS. Neuroblasten werden gemerkt door het injecteren mCherry coderende lentivirus in de SVZ (rood), werden gelabeld door astrocyten injecteren van een lentivirus dat codeert voor GFP onder de controle van een promoter in GFAP de RMS (groen) en bloedvaten werden gemerkt door het injecteren Dextran CascadeBlue (blauw ) in het hart. C) Schematische weergave van de injectie van GAD67-GFP cellen losgemaakt van de SVZ een GAD67-GFP muis in het SVZ van een volwassen wild-type muizen. D) Getransplanteerde cellen GAD67-GFP (groen) waargenomen in de RMS 7 dagen na enting in de SVZ. De RMS is immunogekleurd met GFAP (blauw). E) Getransplanteerde GAD67-GFP-cellen (groen) waren immunopositieve voor Dcx (rood), maar waren immunonegative voor GFAP (blauw). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Time-lapse beeldvorming van neuroblasten. Time-lapse beeldvorming van neuroblast (groen) migratie langs bloedvaten (rood). De pijlen geven de migratiefasen van de neuroblasten en de pijlen geven de stationaire fasen.
Figuur 4. Analyse van neuroblast migratie. (AD) De verschillende stappen van neuroblasten migratie analyse. De rode cirkels geven de verschillende functies in de tekst vermeld. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Video 1. Time-lapse imaging van viraal gelabeld neuroblasten (groen) trekkende langs dextran TexasRed gelabeld bloedvaten (rood). Clik hier om video te bekijken.
Video 2. Tracking neuroblast migratie door Imaris software. Groene stippen geven cellichamen en tracks geven de afstand van de migratie. Klik hier om video te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De juiste targeting van neuronale precursors de juiste hersengebieden is een fundamenteel proces achter de juiste assemblage en functie van neurale circuits. De meeste cellen migreren tijdens de embryonale ontwikkeling en de postnatale hersenen slechts enkele regio's, zoals de OB, dentate gyrus en cerebellum, neuronale verplaatsing nog steeds plaats. De mechanismen orkestreren celmigratie in de postnatale hersenen blijven echter slecht begrepen. Kennis van de mechanismen en moleculaire pathways die betrokken zijn in het begeleiden van celmigratie in volwassen zenuwweefsel zal verbeteren ons begrip van neuronale targeting in de postnatale hersenen en kunnen klinische relevantie voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën moeten neuronale rekrutering te induceren in zieke delen van de hersenen.
In dit manuscript beschrijven we een protocol voor monitoring celmigratie in acute plakken van de volwassen muis voorhersenen. Terwijl we de volwassen SVZ-OBpad als modelsysteem, kan dezelfde techniek worden toegepast op celmigratie volgen in de embryonale en vroege postnatale hersenen en in de volwassen hersenen na letsel. We gebruikten dit protocol om celmigratie volgen in de vroege postnatale RMS 12, cerebellum en volwassen na een beroerte striatum (Eiriz, Grade, Malva en Saghatelyan, ongepubliceerde gegevens).
Beeldvorming van neuroblast migratie werd uitgevoerd met behulp van acute levende plakjes die het mogelijk maken celmigratie worden bestudeerd in een micro-omgeving die nauw bootst in vivo condities. Migrerende cellen werden gevisualiseerd door stereotactische injecties van virale deeltjes of door het enten van neuroblasten reporter muizen in de SVZ van wild-type muizen. De migratie analyse werd ver uitgevoerd vanaf de injectieplaats. Om tangentiële migratie in de RMS te bestuderen, hebben we acute plakjes bereid 3-5 dagen na de neuroblasten werden bestempeld. Radiale migratie in de OB bestuderen, werden de plakjes bereid 7-10 dagen na stereotaxic injectie in de SVZ. Virale gerichte neuronale precursors in de volwassen SVZ ook worden gebruikt om te bestuderen en te moduleren factoren die de migratie van opwaarts reguleren of neerwaarts reguleren specifieke moleculaire signalen. Het is ook mogelijk om verschillende celtypes in de RMS labelen en multi-golflengte beeldvorming uit te voeren om het patroon van migratie neuroblasten ontrafelen langs tracer gevulde bloedvaten 4, 13 of langs viraal of genetisch gemerkt astrocyten 2, 12.
Om beeld neuroblast migratie hebben we gebruik gemaakt van een gemotoriseerde fluorescentie rechtop microscoop uitgerust met een CCD-camera die relatief snelle overnames toegestaan op verschillende z vliegtuigen na korte pulsen (30-100 msec) van excitatie licht. Dit verhinderde fotobleken en verminderde het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende acquisities zonder interferentie met de 3D visualisatie van neuroblast migratie. Andere groepen hebben gebruikt confocale of twee-foton microscoop naar cel MIGR controlerenatie in de postnatale RMS 14-16. Beide technieken hebben hun voordelen en beperkingen, die vooral te maken hebben met temporele en ruimtelijke resoluties vraagstukken. Wij raden het gebruik van korte intervallen (15-30 sec) tussen opeenvolgende acquisities. Pasgeboren neuronen hebben saltatorische gedrag en migratie fasen worden onderbroken door stationaire periodes die kunnen het zo kort 4-10 min 4. Aangezien dit type van migratie, is het belangrijk om betrekkelijk snelle acquisitie intervallen (15-30 sec) gebruik tussen opeenvolgende tijdstippen betrouwbaar identificeren het begin en einde van migratie en stationaire fasen. Dit is moeilijk te bereiken wanneer het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende acquisities in het bereik van enkele minuten. Een nauwkeurige bepaling van de stationaire en migratiefasen moet eenduidig bepalen van de snelheid van migratie neuroblast, die alleen kan worden gekwantificeerd in de migratiefasen 4, 17. Lange intervallen overname kan de berekening van het average snelheid als de afgelegde afstand gedurende een bepaalde periode dat ook stationaire fasen. Veranderingen in de gemiddelde snelheid bepaald door deze werkwijze echter noch kan worden veroorzaakt door verschillen in de mate van migratie (alleen gedefinieerd in migratiefasen) of door de duur van de stationaire fase en migratie. Deze verschillen in acquisitie parameters zijn waarschijnlijk de verschillen in de snelheden van neuroblasten migratie gemeld door verschillende groepen ten grondslag liggen. Door het uitvoeren van een snelle overnames met een 15-30 sec interval en het bepalen van de snelheid van migratie uitsluitend tijdens de migratie fasen, berekenden we een snelheid van migratie van 120-150 micrometer / uur 4, 12, terwijl andere groepen, die gebruik maken van een overname interval van 3-7 min rapporteerde een snelheid van 50-100 micrometer / uur 14, 15, 18. Het belangrijkste nadeel van breedveld fluorescente beeldvorming met CCD camera is dat het lagere ruimtelijke resolutie dan het scannen systemen. Aangezien migreren neuroblasten een compact morphology met soma en korte toonaangevende processen, heeft een lagere ruimtelijke resolutie geen afbreuk aan de betrouwbare identificatie en opsporing van neuroblasten op het niveau van cellichamen en zelfs leidende processen (figuur 3 en Video's 1 en 2).
De techniek die we beschrijven hierin laat neuroblast migratie in een micro-omgeving nauw nabootsen van in vivo omstandigheden te analyseren, de interacties tussen de verschillende componenten van de RMS te bestuderen, en de rol van deze interacties in neuroblast migratie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) subsidie ASJK werd gedeeltelijk ondersteund door een Universite Laval gemeenschap. AS is de ontvanger van een Canada Research Chair in postnatale neurogenese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
