Summary
Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.
Abstract
Yeni fonksiyonel nöronlar yapısal yetişkin memeli beyninde kısıtlı alanlarda nöral kök hücrelerinin endojen bir havuz oluşturulur gösteren kanıt önemli bir gövdesi vardır. Subventricular zon (SVZ) den Yenidoğan nöroblast koku ampul (OB) 1 nihai hedefe rostral göç akışı (RMS) boyunca göç. RMS'de, nöroblast bir yapısal destek ve göç 4,5 için gereken moleküler faktörü kaynağı olarak kan damarlarının kullanılarak astrositik işlemler 2,3 göre ensheathed zincirleri teğetsel göç ederler. OB, nöroblast zincirleri ayırmak ve internöron içine ayırt etmek ve mevcut ağ 1, 6 entegre farklı bulber katmanları içine radyal olarak göç ederler.
Bu yazıda kemirgen beynindeki akut dilimleri izleme hücre göçü için prosedürü açıklar. Akut dilimlerinin kullanılması assessm sağlaryakından vivo koşullarda ve in vivo görüntüleme için ulaşılması zor beyin bölgelerinde andıran bu mikroçevresindeki hücre göçü ent. Buna ek olarak, sonuçta hücre göçü özelliklerini değiştirebilir organotipik ve hücre kültürlerinin olduğu gibi uzun kültür kalıntıları önler. Akut dilimler Nöronal öncüleri DIC optik ya da floresan proteinleri kullanılarak görüntülenebilir. Wild-tip farelerden SVZ'da içine muhabiri fareler nöroblast aşılama ve nöroblast floresan proteini ifade transgenik fareler kullanarak SVZ nöronal öncüllerinin Viral etiketleme, nöroblast görselleştirme ve göç sonrası için tüm uygun yöntemlerdir. Daha sonra yöntem, ancak tek tek hücreler çünkü işaretli hücrelerin yüksek yoğunluklu uzun süre için izlenen izin vermez. Biz nispeten hızlı bir toplama aralığı (bir ima ulaşmak için bir CCD kamera ile donatılmış geniş bir alan floresan dik mikroskop kullanılırge her 15 veya 30 sn) güvenilir sabit ve göçmen fazları belirlemek için. Kırtasiye ve göçmen fazların süresinin kesin tanımlama sonuçlarının kesin yorumlanması için çok önemlidir. Biz aynı zamanda 3D nöroblast göç izlemek için birden z-aşamalı alımlar gerçekleştirilir. Geniş alan floresan görüntüleme nöronal migrasyon 7-10 görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, biz, nöroblast etiketleme yetişkin fare önbeyin akut dilimleri neuroblast göçün gerçek zamanlı video görüntüleme gerçekleştirerek ve hücre göçü analiz etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Açıklanan protokol yetişkin RMS nöroblast göç örnek, aynı zamanda, embriyonik ve erken doğum sonrası beyin hücre göçü takip etmek için kullanılabilir.
Protocol
1. Nöronal Öncüleri Etiketleme
Nöroblast seçici steriotaksik SVZ veya RMS içine floresan proteinleri kodlayan viral parçacıklar enjekte ederek, (yani, DCX-GFP, GAD67-GFP) nöroblast floresan proteinleri ifade transgenik fareler kullanarak görüntülenebilmekte veya gazetecinin fareler nöronal öncülleri aşılama tarafından (yani olabilir , yabani-tip fareler SVZ'da içine Dcx-GFP, GAD67-GFP). Biz aşılama ve nöronal öncüllerinin viral etiketleme prosedürü açıklanmaktadır.
Muhabiri farelerin SVZ gelen nöroblast ve Ayrışma
- Aşağıdaki çözümleri neuroblast ayrılma için gereklidir.
40X çözümü
10 ml Kalem / Strept (Stok Kalem 10.000 u / ml / Strept 1.000 ug / ml)
10 ml Glükoz (Stok 200 mg / ml)
20 ml sodyum piruvat (Stok 100 mM)
ove_content "> 10 ml H2O1 ml alikotları hazırlayın
Diseksiyon çözeltisi (100 mi)
HBSS 1X - 97.4 ml
HEPES (1 M) - 0.1 ml
40X çözüm - 2,5 ml
DNaz çözelti (20K ünite / ml)
DNaseI, sığır pankreas typeIV
150,000 7.5 ml H 2 O içinde çözülür
0.22 mikron Filtreli
1 ml alikotları hazırlayın
Tripsin-DNaseI çözeltisi (10 ml)
HBSS - 8.6 mL
DNaseI (20K ünite / ml) - 0.15 mL
Tripsin-EDTA (% 0.5) - 1 mL
40X çözümü - 0.25 ml
Ufalama çözeltisi (50 ml)
ntent "> Neurobasal orta - 47.5 mlBSA (300 mg / ml) - 332.5 ul
40X çözümü - 1.25 ml
DNaseI (20K ünite / ml) - 0.66 mL
- Uyutmak iki-ketamin / xylazine (10 mg / vücut ağırlığı 10 gr başına 1 mg) 100 ul bir intraperitoneal enjeksiyon ile nöroblast bir floresan proteini ifade üç aylık erişkin fare, sonra başını kesmek. Biz GAD67-GFP fareler 11 kullanın. Bisturi ile, yanal ventrikül seviyesinde koronal beyin dilim, disseksiyon ve buz gibi soğuk bir ortamda SVZ dışarı teşrih. Tripsin-DNase çözelti 500 ul ile bir mikrosantrifüj tüpü içinde SVZ yerleştirin ve 20 dakika için buz üzerinde tutun.
- Önceden ısıtılmış, 5 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içine SVZ aktarın (37 ° C) 37 tripsin-DNase ve çözelti inkübe 30 dakika boyunca% 5 CO2 içinde ° C.
- Trit 15 ml içeren 50 ml'lik konik bir tüp içine tüm içeriği aktarın1 dakika boyunca 1.000 xg'de uration çözüm ve santrifüj. Süpernatan aspire ezerek toz haline getirme çözeltisi, 10 mL, yeni bir 15 ml konik bir tüp, ve 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile hücreler aktarın.
- Trituration orta uç boyutu ve kat azaltmak için bir Pasteur pipeti Yangın parlatın. Aşağıdaki santrifüj mümkün olduğu kadar süpernatan olarak çok kaldırmak ve konik boru ile ezerek toz haline getirme temiz çözelti 2 ml ekleyin. Trituration çözüm hücreleri (Pasteur pipeti ile yaklaşık 50 kat yukarı ve aşağı) Karışım. Iyi disosiye hücreleri içeren süpernatant üst yarısı, al trituration çözelti 10 ml içeren yeni bir 15 ml konik tüp içine aktarın.
- Yangın lehçe ileri ucu boyutunu azaltmak için bir Pasteur pipeti. Kalan ayrışmamış hücreleri içeren tüp trituration çözüm başka bir 1 ml ekleyin, trituration (yaklaşık 10 kat yukarı ve aşağı) devam eder ve 15 ml konik tüp containin için tüm içeriğini aktarmakg Önceden disosiye hücreleri. 7 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüjleyin. Süpernatant Sil neurobasal ortamı, bir sayım bölmesi içine yük 50 ml peletlenmiş hücreleri tekrar askıya, ve hücreleri sayın.
Greft prosedürü kullanarak SVZ içine hücrelerin istenilen sayıda aşağıda açıklanmıştır.
Stereotaksik virüs enjeksiyonundan ve ayrışmış hücre aşılama
- Ameliyat başlamadan önce bir boncuk sterilizatör kullanan tüm araçları sterilize.
- Stereotaksik enjeksiyonları için, beyin hasarı en aza indirmek için çok ince ipuçlarını (1-2 mikron) ile cam mikropipetler kullanın. Bir pipet yapmak için bir pipet çektirmesi ile kılcal cam çekin. Dolgu yarı dolu kadar parafin yağı ile pipet ve pipet tedavi edilmezse sonunda içine nanolitre enjektör (Dünya Hassas Aletler) ve pistonu takın.
- Nanolitre bir enjektör kullanılarak kontrolör, bir küçük dro kadar piston ile yağ aşağıya doğru zorlamakparafin yağı p ince ucundan extrudes. Viral parçacıklar (1x10-6 1x10 8 TU / ml) ya da ayrışmış SVZ hücreleri ihtiva eden bir çözelti içerisinde 0,5-1 ul ile bir steril kap içine pipet indirin. İstenilen solüsyonla pipet doldurmak için nanolitre enjektörün çekilmek işlevini kullanın. Pipet içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Uyutmak iki-ketamin / xylazine bir intraperitoneal enjeksiyonu ile üç aylık erişkin C57BL / 6 fare. Kafasına cerrahi alan tıraş için elektrikli tıraş kullanın. Herhangi yapışık saç kaldırmak için ıslak gazlı bez ile iyice temizleyin.
- Bir stereotaksik çerçeve üzerinde fare yerleştirin ve başlığı düzeltmek. Dezenfektan sabun (Hibitane) ve ardından% 70 alkol (gazlı bez veya sprey) ile birlikte saç ücretsiz enjeksiyon yeri yıkayın. Proviodine (gazlı bez veya sprey) ile site Dezenfekte ve cerrahi alan ile hayvan kapsar.
- Fare sterilize deride küçük bir kesi olun ve dikkatli maruz cilde yayılıraltında kafatası. Kafatası yüzeyi kurulayın. Sırasıyla anterio-posterior (AP) ve medio-lateral (ML) stereotaksik koordinatları ayarlamak için sıfır koordinatları olarak bregma ve orta hat kullanın.
- Uygun koordinatlarda her hemisferin üzerinde kafatasında küçük bir delik açın. Altta yatan beyin dokusu zarar vermekten kaçının. Sadece kemik ihlal edildiği kadar dikkatlice delin. Deliğini temizleyin ve beyin yüzeyinde dorso-ventral (DV) stereotaksik koordinatları sıfır koordinatları ayarlayın. Biz SVZ veya yetişkin RMS (22-24 g) C57BL / 6 fareler içine enjeksiyon için (mm) koordinat aşağıdaki kullanın: SVZ için: AP 0.70, ML 1.20 ve DV 1.90; RMS için: AP 2.55, ML 0.82 ve DV 3.15.
- Yavaşça kılavuzları olarak uygun DV koordinatları kullanarak beynin içine cam mikropipet ucu yerleştirin ve yavaşça hücre süspansiyonu (biz 5 de nl / sn 100-500 nl enjekte) küçük bir miktar enjekte (muhabir farelerin SVZ ayrışmış) veya bir viral partiküller içeren çözüm. Biz genellikle kullanınlentiviral ya da retroviral parçacıklar 1x10-6 1x10 8 TU / ml.
- Yavaşça, cam mikropipet çekilme kafatası üzerinde deri dikiş, ve daha hızlı kurtarma için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Fare ameliyattan sonra uyandığı zaman, yönetmek bir analjezik (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 3 gün post-op sırasında günde 1 enjeksiyon).
2. Akut Dilimleri hazırlanması
- A) yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) sakaroz tabanlı çözüm, bundan NaCl dilim hazırlama prosedürü sırasında artmış nöronal uyarılabilirliği kırmak sükroz ile değiştirilir kesim çözüm olarak anılacaktır: aşağıdaki çözümleri akut dilimleri hazırlamaları gerekmektedir ve b) NaCl içeren ACSF, ° C dilimleri görüntüleme kadar transfer ve muhafaza edildiği bir su banyosu, 32 ısındı.
- Kesme çözelti: 210.3 sükroz, 3 KCI, 1.3 MgCI 2 x6H 2 O, 2. CaCI 2 çözümleri, aşağıdaki (mM olarak) içeren 2 O 26 NaHCO 3 1.25 NaH 2 PO 4, 20 glukoz; ACSF: 125 NaCI, 3 KCI, 1.3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CaCI 2 x2H 2 O, 26 NaHCO 3 1.25 NaH 2 PO 4, 20 glikoz. 7,3-7,4 arasında bir pH değerinde muhafaza çözüm, ve% 95 O2 /% 5 CO2 ile gazı ile sürekli olarak oksijen.
- Ketamin / xylazine bir İntraperitoneal ile fare uyuştur. Sıvı azot kullanarak jöle benzeri bir görünüme sahip buz kesme çözeltisi hazırlayın. 20 cc şırınga kullanarak, bu çözelti ile intracardiacaly fare serpmek.
- Bu prosedür, 20 mL çözelti için 1-2 dakika genellikle, hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Kan damarlarının yerine kesim solüsyonu ile perfüze arasında etiketli gerekiyorsa, kalbin sol ventrikül içine Dekstran Texas Red (10 mg / ml) transcardiacally 200 ul ekleme ve fare decapitating önce 2-3 dakika bekleyin.
- M başını kesmekouse ve hızla buz gibi soğuk kesme çözelti içinde baş batırmak. Kafa derisi kaldırmak ve serebellum gelen OB orta sagital sütür boyunca anterior eksenine posteriordan kafatası kesmek için makas kullanın. Yavaşça forseps kullanılarak kranyal kapakları çıkarın.
- Bir neşter kullanılarak beynin ÖTV kaudal parçası. Intrahemisferik fissür boyunca beyin kesin, ve her hemisferin (Şekil 1A) en lateral kısmında iki sagital kesim yapmak. Hafifçe bir spatula kullanarak beyin çıkarın ve buz soğuk kesim çözüm yerleştirin.
- 4% agar agar dokunmadan dorsal yüzü blok ve bir vibratome bir platforma iki hemisfer ile tutkal blok ayrı ayrı iki hemisfer yerleştirin. Tutkal yanal yukarı bakacak medial tarafında (Şekil 1B) tutarak, platforma yarımkürede yan kesti. Vibratome bir odasında platformu yerleştirin ve çözüm kesme ile doldurun. Sli boyunca oksijenli çözüm tutun% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile köpüren tarafından ce hazırlanması.
- Vibratome kullanarak 250 mikron kalınlığında kesitler hazırlayın. Biz Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) kullanın ve 100 Hz ve 1 mm / sn hızında bir frekansta dilim kesilmiş. Düşük kesme hızı ve yüksek frekanslı titreşim bıçak yüksek kaliteli bölümlerini elde etmek için kullanılmalıdır. En kısa sürede bir dilim bıçak serbest olduğu gibi, yavaşça kesim çözüm çıkarın ve 32 ° C'de su banyosunda (Şekil 1C) muhafaza oksijenli ACSF dolu bir kuluçka odasında yerleştirin.
Bu işlem en kaliteli dilimleri sağlamak için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
3. Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme
Göç nöroblast, görüntüleme nöroblast etiketleme sonra dilimlerinin hazırlanması 6-8 saat ve 3-10 gün içinde yapılmalıdır. Göç parametrelerindeki değişiklikleri önlemek içinçünkü beyin hasarı en aza indirmek için beyin hasarı ve glial aktivasyon kullanımı ince uçlu cam mikroelektrotlar (1-2 mikron) neden ve enjeksiyon sitesinden distal bölgelerde görüntüleme (RMS aşağıdaki yani görüntü gerçekleştirebileceğiniz stereotaksik enjeksiyon SVZ içine veya koku ampul RMS enjeksiyon) RMS içine enjeksiyonu takiben. Görüntüleme SVZ içine lentiviral parçacıkların enjeksiyonundan sonra 21 gün öncesine kadar yapılabilir rağmen görselleştirilmesi ve görüş alanı başına daha fazla hücre izleme verir bu yana, biz kısa enjeksiyon sonrası aralığı (3-10 gün) öneririz.
Biz bir CCD kamera (CoolSnapHQ2, Fotometrik) ve 0.8 sayısal açıklık (Olympus) ile 40X su immersiyon objektif ile donatılmış geniş bir alan floresan motorlu BX61WI mikroskobu (Olympus) kullanılır. Yüksek NA ile hedefleri daha iyi çözünürlükte görüntü sağlayacaktır. Etiketli nöroblast (muhabir donör fare veya viral etiketli ya aşılı) heyecan vardız edinme başına 30-100 msn için 175 W Xenon lamba (Sutter Instruments) ile donatılmış bir Lambda DG-4. Çoklu görüntüleme dalga boyu da bu gibi floresan etiketli astrosit veya kan damarları gibi RMS diğer hücresel elemanlar, nöronal boyunca geçişi izlemek için uygun bir filtre setleri (kroma) kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Mikroskop, CCD kamera ve DG-4 time-lapse toplama programı farklı parametreler (bkz. aşağıda) ayarlamak için izin MetaMorph yazılımı (Moleküler Cihazı) tarafından kontrol edilmiştir. Dilimler mikroskop üzerine inşa edilmiş bir PH1 Serisi 20 ultra-sessiz görüntüleme odası (Harvard Apparatus) transfer edildi. Kamara otomatik ısıtma sistemi (TC-344B, Harvard Apparatus) bağlı ve sürekli olarak oksijenli ACSF (Şekil 1D) ile perfüze edildi. Odasındaki sıcaklık 31-33 ° C de muhafaza ve ACSF bir akış hızı dakika başına 1-2 ml oldu.
- Mikroskop görüntüleme odasında dilim dikkatlice yerleştirin. Karşıgörüntüleme sırasında dilim sürüklenen önlemek, dikkatli dilimin üstüne bir naylon örgü (Warner Instruments) koyarak onu dengelemek. Örgü 0.3 ile 1.13 mm 0.12 mm kalınlığında ve açıklıklar aralığıdır. Bu görüntüleme alanı (Şekil 1D) engel olmayacak şekilde örgü yerleştirin. Ilgi alanı bulmak için bir 10X objektif kullanın ve ardından 40X objektif meşgul ve odağı ayarlayacaktır.
- Dilim sürekli ACSF ile objektif ve dilim arasında yeterli çözüm olduğunu perfüze olduğundan emin olun. ACSF perfüzyon, düzensiz perfüzyon veya ciddi sıcaklık değişimleri sürüklenen nedenleri ve görüntüleme sırasında odak düzlemi değişim oranı değişiklikler.
- Toplama sistemi denetleyen MetaMorph yazılımı kullanarak time-lapse edinimi parametreleri (yani eksitasyon süresi, z uçak sayısı, her z bölüm arasındaki mesafe, süre ve kayıt süresi) ayarlayın ve zaman başlayacak edinimi sukut. Data otomatik edinilen time-lapse video bir kez noktasına karşılık gelen her dosya bir tiff dosyaları olarak MetaMorph tarafından kaydedilir.
- En az 1-2 saat boyunca görüntüleme gerçekleştirin ve iki sabit fazlar tarafından kesilir dikkate göçmen aşamaları dikkate almak. Görüntüleme nöroblast göç özelliklerinde hiçbir değişiklik yapmadan 4 saat (biz fazla 4 saat süren görüntüleme oturumları gerçekleştirmek vermedi) 'e kadar yapılabilir. Dilim yüzeyinde görüntü hücreleri etmeyin. 20 ila 100 um arasında bir derinliğe Genellikle görüntüsü. Güvenilir sabit ve göç fazların başlangıcını ve sonunu belirlemek için - Biz kısa edinimi aralıklarla (30 saniye 15) kullanmanızı öneririz.
- Nöronal sinir hücrelerinin göçünü de spesifik moleküler faktörlerinin katılımı değerlendirmek için, normal bir ACSF ACSF istenen herhangi bir farmakolojik madde (yani, farklı agonistleri, antagonistleri, bloker, büyüme faktörleri, vs) ihtiva eden ile ikame edilebilir. En azından görüntüleme gerçekleştirin1. kontrol koşulu saat ve daha sonra farmakolojik ajan varlığında 1 saat boyunca.
4. Neuroblast Göç Analizi
Biz verileri analiz etmek Imaris yazılımı (Bitplane) kullanın. Bu bize otomatik 3D yenidoğan hücre göçü izlemenize olanak sağlar. Imaris 7.0F1 paketi MeasurementsPro, Imaris Takibi, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer ve Parlak, Baskıda modülleri içerir.
- Imaris filmin açmak için, basitçe sürükleyip ve program simgesini videonun ilk kez noktasının görüntüsünü bırakarak elde edilen görüntü (tiff dosyaları) yükleyin.
- Film yüklendikten sonra, Ekran ayar penceresinde sinyalinin parlaklık ve kontrastı ayarlamak ve Görüntü özelliklerinde kazanılmış video (voksel boyutu ve zaman aralığı) parametrelerini ayarlamak ve paralellerin zaman noktalarında pencereleri (Şekil 4A) ayarla . Voksel boyutu belirttikten sonra, 3B olarak çerçeve hem de zaman ve ölçek görmek mümkündürvideo.
- Otomatik Kaydedilen hücreleri izlemek için, Spotlar işlevi seçerek Aşan penceresinde alanında her hücre için bir nokta oluşturmak. Adımları izleyin ve görüntülü nesneleri (Şekil 4B) esas parametrelerini ayarlamak. Parametrelerinden biri Dilim pencere içinde ölçülebilir hücre çapı.
- Zaman içinde saptanan nesnelerin güvenilirliği kontrol edin. Tüm göç hücreleri otomatik olarak tespit edilmezse, algılama eşiği (Şekil 4B) değiştirebilir ve tüm hücreler her zaman noktalarında noktalar ile seçili olduğundan emin olun.
- Komşu zaman noktalarında iki nesneleri kendi sınırları / kenarları arasında herhangi bir çakışma varsa otomatik izleme sırasında, bir parça bağlantısı her örtüşme yapılacaktır. Aynı parçanın komşu zaman noktaları temsil eden iki nokta arasındaki maksimum mesafe ve maksimum boşluk boyutu (Şekil 4C) Program süresi Ucu bağlayabilirsiniz böylece belirtilmesi gerekiyorts. Maksimum mesafe zaman noktalarında daha sonraki aynı nesne arasındaki mesafe tarafından belirlenir.
- Parça yapıldıktan sonra, bu parçaları filtre ve sadece onları (Şekil 4C) silerek alakasız parçaları çıkartmak mümkündür. Parçalar farklı parçaları ve aynı parçanın farklı zaman noktalarında (Şekil 4C) bağlamaya ve sökmeye düzeltilebilir.
- Bir zamanlar tüm düzeltmeler yapılmış, parçaları bir final göz atın ve bir Excel dosyası (Şekil 4D) verileri (zaman noktası başına hücre değiştirme, hat uzunluğu, deplasman uzunluğu, parça süresi vs) ihracat.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Biz test edilmiş ve neuroblast göç geniş alan time-lapse görüntüleme optimize. Viral etiketlenmesi veya göç hücreleri sağlam GFP ifade (Şekil 2) için izin SVZ içine floresan etiketli nöroblast aşılama. Çoklu dalgaboyu görüntüleme b olabilire gibi dekstran TexasRed dolu kan damarlarının 4 (Şekil 3 ve Film 1), floresan bir glial hücre spesifik promotor (Şekil 2B) 12 ile virüs stereotaksik enjeksiyonu ile etiketli astrositler gibi RMS diğer hücresel elemanlar birlikte neuroblast göç görselleştirmek için uygulanan ya da özellikle transgenik hayvanlarda astrositler etiketlenmiştir.
Bir sabit faz ayrılmış ön işlem karşı nöronal hücre gövdesi yer değiştirmesi (Şekil 3, 1 ve 2 Film): akut dilimleri içinde neuroblast göç geniş alanlı bir video görüntüleme iki farklı faz oluşur nöronal sinir hücrelerinin geçirme sıçrayabilen davranış göstermiştir . Kırtasiye ve göçmen aşamaların süresi belirlemek güvenilir etmek ve bu deplasman (göç aşamalarında sadece hesaplanan) oranı gibi diğer hücre göçü parametreleri elde etmek, görüntüleme kısa edinimi aralığı (bir kez 15 başına kullanarak 3D yapıldı veya 30 sn). Sabit ve göç fazların sürelerinin kesin kimlik verilerinin kesin yorumlanması için çok önemlidir. Örneğin, belirli bir zaman diliminde göçün mesafesi farklılıklar göç oranındaki değişikliklerden ya da göç ve durgun faz süresi veya peryotlarla değişiklikler yoluyla uyarılabilir. Bu farklı olasılıklar uzun edinimi aralıkları kullanılarak ayırt edilemez.
Imaris yazılım 3D nöroblast göç analiz etmek için ve bu tür parça süresi ve hat uzunluğu, hem de yer değiştirme vektörü, bir parça deplasman uzunluğunu gibi hücre göçü ilave parametreler elde etmek için kullanılmıştır. Parça doğrusallık da parça değiştirme uzunluğuna göre hat uzunluğu bölünmesiyle hesaplanır ve bireysel neuroblast arasında göç rotasının doğrusallık gösterir edilebilir.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Şekil 1. Akut canlı dilim hazırlanması şematik gösterimi. Kaudal, bir intrahemisferik ve iki sagital kesim A) şematik gösterimi. Vibratome ve agar blok ve platform üzerinde fare beyin yerleştirerek B) şematik gösterimi. Akut dilim inkübasyon odasının C) şematik gösterimi. Dik mikroskop üzerine inşa görüntüleme odasının D) şematik gösterimi.
Şekil 2. RMS nöroblast Etiketleme. Nöroblast ve yetişkin RMS kan damarlarının sağlam etiketleme gösteren A) Düşük büyütme görüntü. Bir retrovirüsün kodlama GFP SVZ içine enjekte edildi, ve GFP-ifade eden hücreler (yeşil) 3 gün (sol panel) sonra RMS tespit edilmiştir. Kan damarları dekstran fare kalbinde (kırmızı, sağ panel) içine TexasRed enjekte etiketli. Inset yüksek magnific gösterirkan damarları ve kan damarları ile ilişkili viral etiketli nöroblast arasında ation görüntü. Erişkin RMS farklı hücresel elemanlar B) Etiketleme. Nöroblast SVZ (kırmızı) mCherry-kodlama lentivirüs enjekte etiketli, astrositler RMS (yeşil) bir GFAP promotör kontrolü altında lentivirüs kodlama GFP enjekte etiketli edildi ve kan damarları Dekstran CascadeBlue (mavi enjekte etiketli edildi ) kalbinde. Yetişkin bir vahşi-tip fare SVZ'da içine bir GAD67-GFP fare SVZ'da ayrışmış GAD67-GFP hücrelerinin enjeksiyonu C) şematik gösterimi. D) nakledilen GAD67-GFP hücreler (yeşil) SVZ greftleme sonrasında RMS 7 gün algılandı. RMS GFAP (mavi) ile immünhistokimyasal edilir. E) nakledilen GAD67-GFP hücreler (yeşil) Dcx (kırmızı) için immünohistokimyasal, ama GFAP (mavi) için immünreaktivitesi vardı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Kan damarları boyunca neuroblast arasında nöroblast Time-lapse görüntüleme. Time-lapse görüntüleme (yeşil) göç (kırmızı). Oklar nöroblast göç aşamaları göstermektedir, ve ok uçları sabit faz göstermektedir.
Şekil 4. Neuroblast göç Analizi. (AD) nöroblast göç analizinin farklı basamakları. Kırmızı daireler metinde bahsedilen farklı fonksiyonlar gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Dekstran birlikte viral etiketli nöroblast Video 1. Time-lapse görüntüleme (yeşil) göç etiketli kan damarlarının (kırmızı). TexasRed CVideoyu izlemek için burayı yalamak.
Video 2. Imaris yazılım tarafından neuroblast göç Takip. Yeşil nokta hücre gövdeleri gösterir ve parça göç mesafeyi belirtmektedir. Videoyu izlemek için burayı tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun beyin bölgelerine nöronal öncüllerinin doğru hedefleme nöral devrelerin düzgün montaj ve fonksiyonu altında yatan temel bir süreçtir. Hücrelerin büyük çoğunluğu embriyonik gelişim sırasında göç ve sadece bu OB, dentat girus ve beyincik gibi birkaç bölgelerde doğum sonrası beyindeki nöronal yerinden hala yer alır. Postnatal beyin hücre göçü düzenlediğini mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ancak kalır. Olgun sinir dokularında hücre göçü rehberlik dahil mekanizmaları ve moleküler yolaklar bilgisi postnatal beyinde nöronal hedefleme anlayışımızı geliştirmek ve beynin hastalıklı alanlara nöronal işe ikna etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için klinik öneme sahip olabilir.
Bu yazıda, erişkin fareden önbeyin akut dilimleri izleme hücre göçü için bir protokol açıklar. Biz yetişkin SVZ-OB kullanılmadıbir model sistem olarak yol, aynı teknik embriyonik ve erken doğum sonrası beyin hem de yetişkin beyin yaralanması ardından hücre göçü takip uygulanabilir. Biz erken postnatal RMS 12, serebellum ve yetişkin inme sonrası striatum (Eiriz, Sınıf, Malva ve Saghatelyan, yayınlanmamış veri) hücre göçü takip için bu protokolü kullanılır.
Neuroblast göç Görüntüleme hücre göçü yakından vivo koşullarda taklit bir mikro okudu izin akut canlı dilimleri kullanılarak yapıldı. Geçiş hücrelerin viral partiküller stereotaksik enjeksiyon yoluyla ya da yabanıl tip fareler SVZ'da içine raportör farelerden alınan nöroblast aşılama yoluyla görüntülenmiştir. Göç analiz enjeksiyon bölgesinden uzakta yapıldı. RMS teğet göç incelemek için, 3-5 gün nöroblast etiketli sonrasında akut dilimleri hazırlanmıştır. OB radyal göç incelemek için, dilim 7-10 gün ste sonra hazırlandıSVZ içine reotaxic enjeksiyon. Viral SVZ ayrıca incelemek için kullanılabilir yetişkin nöronal öncüleri hedef ve spesifik moleküler ipuçları regülasyonunda veya downregulating tarafından göç sürecine dahil faktörler modüle. Bu RMS farklı hücre tipleri etiket ve tracer doldurulmuş kan damarları, 4, 13 veya boyunca viral ya da genetik olarak etiketlenmiş astrositler 2, 12 boyunca nöroblast göç model çözmek için çoklu dalga boyu görüntüleme gerçekleştirmek de mümkündür.
Görüntü neuroblast göç için biz uyarma ışık kısa darbeler (30-100msec) ardından farklı z uçaklar nispeten hızlı satın izin bir CCD kamera ile donatılmış motorize floresans dik mikroskop kullanılır. Bu photobleaching engelledi ve neuroblast göç 3D görselleştirme ile müdahale olmadan iki sonraki alımların arasındaki zaman aralığını azaldı. Diğer gruplar hücre migr izlemek konfokal veya iki-foton mikroskoplar kullanmışPostnatal RMS 14-16 lenmesi. Her iki teknik özellikle temporal ve uzaysal çözünürlüğü sorunlarıyla ilişkilidir kendi avantajları ve sınırlamaları vardır. Biz birbirini satın almalar arasında kısa aralıklarla (15-30 sn) kullanmanızı öneririz. Yenidoğan nöronlar sıçrayabilen davranış var ve göç aşamaları 4-10 dk 4 gibi kısa olabilir durağan dönemlerde kesintiye uğruyor. Bu tür göç dikkate alındığında, güvenilir göç ve durgun faz başına ve sonuna tanımlamak için ardışık zaman noktaları arasında nispeten hızlı toplama aralıklarla (15-30 sn) kullanmak önemlidir. Bu, iki ardışık satın alma arasındaki süre birkaç dakika arasında olduğunda elde etmek zordur. Sabit ve göç evreleri kesin bir kararlılıkla açıkça göç aşamaları 4, 17 boyunca sadece niceliksel hale getirilmeli neuroblast göç hızı, tanımlamak için gereklidir. Uzun edinimi aralıklarla averag hesaplamak için izin verirmesafe olarak e hızı da sabit fazlar içeren belli bir süre dolaştı. Bu yöntem tarafından tanımlanan ortalama hız değişiklikler, ancak, göç oranı farklılıkları (göç aşamalarında yalnızca tanımlanır) veya sabit ve göç aşamaların süresi ya neden olabilir. Edinimi parametrelerinde Bu farklılıklar farklı gruplar tarafından bildirilen nöroblast göç hızlarında farklılıklar temelini muhtemeldir. Bir kazanım aralığı kullanan diğer gruplar, kim ise bir 15-30 saniye aralıklarla hızlı satın almalar yapan ve göç aşamalarında sadece göç oranının belirlenmesinde, biz, 120-150 mikron / saat 4, 12 göç hızı hesaplanır 3-7 dk 50-100 um / h, 14, 15, 18 'lik bir hızda bildirmiştir. CCD kamera ile geniş alan floresan görüntüleme temel dezavantajı tarama sistemleri daha düşük uzaysal çözünürlüğü sağlamasıdır. Ancak, bu yana göç nöroblast kompakt morp varsoma ve kısa yol açan süreçleri ile hology daha düşük bir çözünürlüğe uzaysal hücre gövdelerinin seviyesinde nöroblast güvenilir şekilde tanımlama ve izleme engel olan ve hatta önemli süreçler (Şekil 3 ve Resim 1 ve 2) etmez.
Biz burada tarif tekniği yakından analiz edilmesi in vivo koşullarda taklit bir mikroçevresindeki neuroblast göç, RMS farklı bileşenler arasındaki etkileşimleri incelenmiştir izin verir, ve neuroblast göç bu etkileşimlerin rolleri tespit edilecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Université Laval burs tarafından desteklenmiştir ASJK için Sağlık Araştırması (CIHR) hibe Kanadalı Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. AS Postnatal nörogenez bir Kanada Araştırma Başkanı sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
