Summary
I denne protokol vi vise hvordan man opfører brugerdefinerede kamre, der tillader anvendelsen af en jævnstrøm elektrisk felt for at aktivere time-lapse imaging af voksen hjerne afledt neural precursorcelletype translokation under galvanotaxis.
Abstract
Opdagelsen af neurale stam-og progenitorceller (samlet betegnet neurale precursorceller) (NPC) i den voksne pattedyrhjernen har ført til en omfattende forskning med henblik på at udnytte de multipotente og proliferative egenskaber af disse celler til udvikling af neuroregenerative strategier. Et afgørende skridt for en vellykket gennemførelse af sådanne strategier er mobilisering af NPCs mod en læsion site efter exogent transplantation eller at øge svar af de endogene prækursorer, der findes i periventricular region af CNS. Derfor er det vigtigt at forstå de mekanismer, der fremmer, vejlede og forbedre NPC migration. Vores arbejde fokuserer på udnyttelse af jævnstrøms elektriske felter (dcEFs) at fremme og direkte NPC migration - et fænomen kendt som galvanotaxis. Endogene fysiologiske elektriske felter fungerer som kritiske signaler for cellemigrering under normal udvikling og sårheling. Farmakologisk afbrydelse aftrans-neuralrøret potentiale i Axolotl embryoner forårsager alvorlige udviklingsmæssige misdannelser 1. I forbindelse med sårheling, er hastigheden for reparation af sårede hornhinde direkte korreleret med størrelsen af den epitel sår potentiale, der opstår efter beskadigelse, som det fremgår af farmakologisk forøgelse eller afbrydelse af denne dcEF 2-3. Vi har vist, at voksne subependymale NPCs undergår hurtig og rettet katodisk migration in vitro, når de udsættes for et eksternt påført dcEF. I denne protokol beskriver vi vores laboratorium har teknikker til at skabe en enkel og effektiv galvanotaxis assay for høj opløsning, langvarig observation af direkte cellelegemet translokation (migration) på en enkelt-celle niveau. Dette assay ville være egnet til at undersøge de mekanismer, der regulerer dcEF transduktion ind cellulære motilitet ved anvendelse af transgene eller knockout-mus, korte interfererende RNA eller specifikke receptor-agonister / antagonister.
Protocol
Alle procedurer, der involverer håndtering af dyr blev godkendt af University of Toronto Animal Care udvalg i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer (protokol nr. 20.009.387). Følgende metoder bør udføres med sterile redskaber og teknikker, i en laminar strømningshætte givet fald.
I protokollen teksten nedenfor, henviser udtrykket "EFH-SFM" til serumfrit medium suppleret med epidermal vækstfaktor, basisk fibroblastvækstfaktor og heparin. EFH-SFM bruges, når undersøger galvanotaxis af udifferentierede NPCs fordi disse mitogener opretholder NPCs i deres udifferentierede tilstand 4. I undersøgelsen af galvanotaxis af NPCs induceret til at differentiere til modne celletyper, "FBS-SFM" henviser til serumfrit medium suppleret med 1% kalvefosterserum. FBS fremmer differentiering af NPCs til modne neurale fænotyper 5.
1. Isolering og dyrkning af neurale Precursors (Notvist i video)
- Bedøve et CD1 mus (6-8 uger gamle) med isofluoran og offer via cervikal dislokation.
- Slukke hovedet i 70% ethanol og halshugge dyret med skarp dissektion saks.
- Mens du holder hovedet med kirurgiske pincet, fjern skindet på ryg overfladen for at blotlægge kraniet.
- Under anvendelse af en skalpel og ingen. 11 klinge, score kraniet ved pandehulen langs mediolateral aksen, og også langs den sagittale sutur i rostrocaudal retning.
- Skræl parietale knogler væk fra hovedet med no. 7 buede pincet, pas på ikke at gennembore hjernevæv.
- Indsæt en tynd spatel under hjernen startende fra under cerebellum og går frem mod de olfaktoriske pærer. Mens du holder kraniet på plads med en pincet, forsigtigt trække hjernen fra kraniet og straks placere den i iskoldt kunstig cerebrospinalvæske (se opskrifter nedenfor).
- Under en dissektion mikroskop, under anvendelse af steriltdissektion saks og pincet klippe hjernen i halvdelen langs midterlinien. Rotere hver halvkugle, således at den mediale (cut) overflade vender opad.
- Vælg en halvkugle, og med den mediale overflade, der vender opad, splenium af corpus callosum (posterior region af corpus callosum) lokalisere.
- Lave et snit fra overfladen af cortex for splenium af corpus callosum langs dorsoventral akse.
- Træk indridset cortex mod lugtekolben at blotlægge de mediale og laterale vægge af den laterale ventrikel.
- Drej halvkugle, således at den dorsale overflade vender opad, og anvende buede microscissors til at skære og samle de blotlagte mediale og laterale vægge, som indeholder den periventricular region, hvor NPC'ere opholde 6.
- Gentag trin 1,8-1,11 for den anden halvkugle.
- Pipetteres det isolerede væv i 7 ml trypsinopløsning (se opskrift nedenfor) i en 15 cc rør, og placer røret på en rocker i en 37 ° Cinkubator i 25 minutter.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter, aspireres supernatanten og resuspender væv i 2 ml trypsininhibitor opløsning (se opskrift nedenfor).
- Forsigtigt tritureres vævet med en lille borehullet Pasteur pipette 30-50 gange omhyggeligt for at undgå luftbobler.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter, supernatanten aspireres, og resuspenderes i 1-2 ml SFM (se opskrift nedenfor) ved triturering pelleten 3-5 gange.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 3 minutter, aspireres supernatanten og resuspender i 1 ml SFM + EFH.
- Tælle levende celledensitet med et hæmocytometer og plade cellerne i en T25 dyrkningskolbe ved en tæthed på 10 celler pr pi i SFM + EFH.
- Tillad kulturen at vokse i 7 dage uforstyrret til opnåelse af fritflydende primære neurosfærer der består af NPC.
2. Galvanotaxis Chamber Forberedelse
- Anbring 3 kvadrat glas no. 1 dækglas (22 x 22 x 0,17 mm) ina flaske 6 N saltsyre natten over.
- Den næste dag, skal du bruge en diamant-tip glas-cutter til at skære 6 rektangulære strimler (22 x 5 x 0,17 mm) af glas fra firkantet nej. 1 dækglas.
- Overfør syrevaskede firkantede underkjoler og rektangulære podekviste ind i en laminar flow hætte. Vask de rektangulære og kvadratiske strimler først med 70% ethanol, derefter med vævskultur-grade autoklaveret vand, og lad den tørre på en Kim wipe (for tilsat sterilitet, kan glasset få lov til at lufttørre).
- Anvende vakuum fedt til omkredsen af en overflade af de kvadratiske objektglas og forsegle dem til bunden af 60 mm petriskåle af plast.
- Anvende vakuum fedt langs den lange akse af den ene overflade af de rektangulære glas strimler, og forsegle dem til modstående kanter af de kvadratiske objektglas (således at de er parallelle med hinanden) for at skabe en central trug.
- UV-sterilisering kamrene i mindst 15 minutter i laminar strøm-hætte.
- Pipette 250-300 pi poly-L-lysine på den centrale trug af kamrene og inkuber ved stuetemperatur i 2 timer.
- Ca. 15 minutter før afslutningen af inkubationsperioden fremstille Matrigel opløsning (se opskrift nedenfor).
- Aspirer poly-L-lysin, vaskes de centrale trug med 1 ml autoklaveret vand, og pipetten 250 til 300 pi Matrigel opløsning på de centrale trug.
- Inkuber kamrene ved 37 ° C i 1 time.
- Aspirer Matrigel opløsningen og forsigtigt vaske de centrale trug med 1-2 ml SFM.
- Der afpipetteres 100 ul EFH-SFM eller FBS-SFM på de centrale trug og overføre de galvanotaxis kamre på scenen af en optælling mikroskop.
- Afpipetteres 3-4 ml neurosfæren-holdige kultur ind i en 60 mm petriskål og overføre petriskålen til den fase af tælle mikroskop.
- Ved en visning mål 5x, skal du bruge en P10 pipette til at overføre 5-8 hele neurosfærer (op til fire ad gangen) på den centrale trug af hver galvanotaxiskammer uden at ophæve dem, og omhyggeligt sprede neurosfærer omkring den centrale trug uden at forstyrre den Matrigel substrat.
- Tilføj yderligere 150-200 pi EFH-SFM eller FBS-SFM på de centrale trug.
- Overfør galvanotaxis kamre i en 37 ° C, 5% CO2, 100% befugtet inkubator i 17 til 20 timer (hvis analyse af udifferentierede NPC) for at tillade neurosfærer at klæbe til Matrigel substrat og dissociere til enkelte celler som vist i figur 1 . Hvis der analyseres differentierede NPC, bør inkubationstiden forlænges til 69-72 timer for at tillade differentiation af cellerne.
3. Levende Cell Time-Lapse Imaging
- Tillade levende celler for at ækvilibrere ved 37 ° C, 5% CO2 i mindst 30 min før initiering af den tidsforskudt optagelse.
- Skær to 12 cm stykker 1 mm diameter Sølv wire, spole dem fra den ene ende, og læg dem i Clorox budvasket i 20 minutter til dannelse af Ag / AgCl elektroder.
- Overfør galvanotaxis kamre på scenen af en optælling mikroskop og vælge hvilket kammer vil blive anvendt til live-cell imaging migrationsanalyse baseret på følgende kriterier: i) neurosfærer bør være næsten fuldstændig dissocieret til enkelte celler og ii) cellerne skal have runde morfologier med små-til-ingen processer strækker sig fra cellelegemerne.
- Overfør det valgte galvanotaxis kammeret i en laminar strømningshætte, sammen med en separat firkant no. 1 glas dækglas og vakuum fedt.
- Vask dækglasset først med 70% ethanol, derefter med autoklaveret vand, og anvende en strimmel af vakuum fedt på to parallelle kanter af dækglasset.
- Aspirér dyrkningsmediet fra den centrale trug af kammeret, så hurtigt placere dækglasset (fedt-side nedad) på kammeret, således at fedt strimler hviler på de to parallelle rektangulære glas strimler, effektivt at skabe et tagtil kammeret.
- Tilsæt 100 pi af frisk EFH-SFM eller FBS-SFM i den centrale trug via kapillarvirkning.
- Brug vakuum fedt for at skabe grænser for puljer af dyrkningsmedier på hver ende af den centrale trug, som vist i figur 2.
- Skær to 15 cm stykker af PVC-slanger, og brug en 10 cc sprøjte med en 18 gauge nål til nøje at injicere agaroseopløsning i rørledningen, hvilket sikrer ingen bobler dannes i rørene, og tillade gelen at størkne i 5 minutter.
- Overfør galvanotaxis kammer til det levende celler system, sammen med agarosegel rør, Ag / AgCI-elektroder, og et par tomme 60 mm petriskåle, der skal anvendes som dyrkningsmedier reservoirer og vil indeholde den Ag / AgCl-elektroder. Tillade galvanotaxis kammer til at hvile inden for 37 ° C, 5% CO2 miljø for 20-30 min.
- I løbet af denne tid, forberede lågene af de 2 tomme petriskåle og låget af galvanotaxis kammerets petriskål ved at bore hullerind i dem med et Dremel eller lignende værktøj som vist i figur 3..
- Pipette 1-1,5 ml EFH-SFM eller FBS-SFM på hver side af den centrale trug, og 7-8 ml af SFM i hver tom petriskål. Sted en petriskål på hver side af galvanotaxis kammerets centrale trug og placere en Ag / AgCI-elektroden i hver skål. Bro over kløften mellem galvanotaxis kammer og petriskåle til at etablere elektrisk kontinuitet med agarosegelen broer, som vist i figur 4.
- Tilslut Ag / AgCl elektroder til en ekstern strømforsyning, med et amperemeter i serie til måling af elektrisk strøm, og tænd for strømforsyningen. Brug et voltmeter til måling af styrken af det elektriske felt direkte over den centrale trug, og justere udgangseffekten fra strømforsyningen, indtil den ønskede elektriske feltstyrke er opnået (de assays, der udføres i dette laboratorium anvendes en dcEF styrke på 250 mV / mm med elektrisk strøm mellem 1 og 1,5 mA).
- Initiativete den time-lapse modul på levende celler system, og, om forsøget løbe i den ønskede tid. Efter afslutning af assayet, fikseres cellerne i 4% paraformaldehyd i standard immunfarvning analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinematisk analyse viser, at i nærværelse af et 250 mV / mm dcEF, udifferentierede NPCs udviser stærkt rettet og hurtig galvanotaxis mod katoden (figur 5A, Movie 1). I mangel af en dcEF, er tilfældige bevægelse af cellerne observeret (fig. 5B, Movie 2). På dette feltstyrke, migrerer> 98% af udifferentierede NPCs for hele 6-8 timer, som de er afbildet, og da døde celler ikke migrerer dette tyder på, at de forbliver levedygtige i denne periode i fravær eller nærvær af en dcEF.
Differentierede fænotyper undergår ubetydelig migration både i nærvær og fravær af en dcEF (film 3, 4). Delmængder af differentierede celler strækker processer har tendens til at bringe vinkelret på retningen af dcEF, men ingen mærkbar cellelegeme translokation observeres.
Immunfarvning kontrollerer, at NPCs opretholder positiv expression af den neurale forstadie markør nestin efter 6 timer i dcEF eksponering (figur 6A). I de assays, der involverer NPC'erne induceret til at differentiere til modne fænotyper, udtrykker de fleste celler det modne astrocyt markør glialt fibrillært surt protein (GFAP) efter 6 timer i dcEF eksponering (figur 6B).
De primære antistoffer anvendt i disse analyser var som følger: monoklonale muse anti-nestin (1:400, Millipore, Canada), og polyklonalt kanin-anti-GFAP (1:500, Sigma, Canada). De sekundære antistoffer blev anvendt i disse analyser var som følger: gede-anti-mus konjugeret med Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canada), og gede-anti-kanin konjugeret med Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Canada).
Figur 1.. Neurosfærer klæbe til Matrigel substrat og dissocispiste i enkelte celler efter 17 timers inkubation ved 37 ° C / 5% CO2, 100% fugtighed i EFH-SFM.
Figur 2. Illustration af galvanotaxis kammer. Strimler af vakuum fedt bruges til at skabe en pulje af dyrkningsmedier på hver side af den centrale trug.
Figur 3. Skematisk af huller, der skal bores ned lågene i galvanotaxis kammer og dyrkningsmediet reservoirer. De 7 mm diameter huller i begge låg anvendes til at indsætte agarosegel rør. De 4 mm diameter huller i låget til galvanotaxis kammer anvendes til at måle det elektriske potentiale direkte over den centrale trug hjælp af et voltmeter. Den 4 mm diameter hul i låget af dyrkningsmediet reservoir er at tillade Ag / AgCI-elektroden at rage frem fra låget af skålen for tilslutning til strømforsyning.
Figur 4. Illustration af galvanotaxis kammerkonstruktion for time-lapse imaging. The galvanotaxis kammer er den centrale petriskålen, hvori cellerne udplades. Mediet inde i centrale petriskålen huser galvanotaxis kammer er enten SFM + EFH eller SFM + 1% FBS. Petriskålene på hver side af galvanotaxis kammeret er fyldt med SFM, og også indeholde Ag / AgCl elektroder. Disse elektroder er forbundet til en ekstern strømforsyning, og bygge bro de tre petriskåle med agarose-gel broer danner en komplet kredsløb.
Figur 5. På præsentace af en dcEF udifferentierede NPCs undergå hurtig galvanotactic migration mod katoden (A), mens det i mangel af en dcEF cellerne undergår tilfældig radial migration (B).
Figur 6. Immunfarvning kontrollerer, om NPCs forbliver nestin-positive udifferentierede forstadier efter 6 timer i dcEF eksponering (A), og at NPC induceres til at differentiere meste udtrykke det modne astrocyt GFAP markør efter 6 timer i dcEF eksponering (B).
Movie 1. Time-lapse video af udifferentierede NPCs udsat for en dcEF. NPCs udpladet på galvanotaxis kamre i 17 timer i SFM + EFH, og derefter udsat for en 250 mV / mm dcEF udviser hurtig og dirigeret migration mod katoden. 1 sekunds video = 15 minutter realtid. Klik her for at se movie.
Movie 2. Time-lapse video af udifferentierede NPCs i fravær af en dcEF. NPCs udpladet på galvanotaxis kamre i 17 timer i SFM + EFH og derefter afbildes i fravær af et tilført dcEF undergår random migration. 1 sekunds video = 15 minutter realtid. Klik her for at se film .
Movie 3. Time-lapse video af differentierede NPCs udsat for en dcEF. NPCs udpladet på galvanotaxis kamre for 69-72 timer i SFM + FBS, og derefter udsat for en 250 mV / mm dcEF udviser meget lidt migration i alle retninger. 1 sekunds video = 15 minutter realtid. Klik her for at se film .
Movie 4. Time-lapse video af differentierede NPCs i mangel på en dcEF. NPCs udpladet på galvanotaxis chambers for 69-72 timer i SFM + FBS og derefter afbildet i fravær af et tilført dcEF udviser meget lidt migration i alle retninger, der svarer til differentierede NPC, der udsættes for en dcEF. 1 sekunds video = 15 minutter realtid. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er blevet tilpasset fra de veletablerede metoder til tidligere undersøgelser 7-9. Galvanotactic kamre kan konstrueres ved anvendelse af en række forskellige teknikker, herunder konstruktionen af et separat glas godt for indespærring af cellepodning, eller ved hjælp af CO 2-laser ablation til mikrofabrikation af den centrale trug 10,11. Nogle teknikker kan være mere arbejdskrævende eller dyre end andre. Vi har beskrevet en enkel og omkostningseffektiv analyse for at konstruere en NPC galvanotaxis kammer ved hjælp af materialer, der almindeligvis findes i de fleste celle biologiske laboratorier. Vores protokol omfatter en opvarmet, befugtet, CO2 reguleret inkubator, der omgiver levende celler til opretholdelse af cellerne under optimale betingelser til kontinuerlig langvarig billeddannelse. Manglen på et sådant apparat er en begrænsning af nogle tidligere publicerede teknikker 9,12.
Nyligt arbejde af en anden gruppe viste lignende galvanotactic opførsel af celler fra en hippocampalt cellelinje 13, ved hjælp af en anden protokol og et mere arbejdskrævende galvanotaxis kammer design. Vores assay er særlig elegant, idet den indeholder en analyse af den samme begyndende cellepopulation - primære cellekulturer af udifferentierede neurosfæreceller afledt NPCs - der er blevet udsat for forskellige betingelser og derved muliggør en sammenligning af de migrerende egenskaber af både udifferentierede og differentierede celler, blot ved at ændre de faktorer, der anvendes til at supplere dyrkningsmedier i galvanotaxis kammeret.
Analysen præsenteres i denne protokol er et kraftfuldt værktøj for langsigtet sporing og analyse af NPC galvanotaxis, og muligvis andre celletyper, der undergår galvanotactic migration 14,15. Som med enhver protokol, kan nuancer i forberedelsen og gennemførelsen af visse skridt i denne protokol føre til mislykkede resultater. Følgende retningslinjer og forslag skal sombestå i en vellykket gennemførelse af denne protokol:
- For at forhindre cellerne i at undergå elektrisk strøm-associeret varmedød, er dimensionerne af galvanotaxis kammer er beregnet til at minimere virkningerne af joule-opvarmning 16. Varmen, der dannes i kammeret er proportional med kvadratet på strømmen, der løber gennem det, som igen er proportional med tværsnitsarealet af galvanotaxis kammeret. Vi anbefaler opretholdelse af tværsnitsarealet af kammeret som 2,04 mm2 (12 mm x 0,17 mm).
- Efter 7 dages dyrkning neurosfærer kan opsamles, dissocieret til enkelte celler og genudpladet i vækst-faktor-betingelser (en proces benævnt "passage") til opnåelse af sekundære neurosfærer. Vi opnår vores bedste resultater ved hjælp af neurosfærer der er blevet underkastet mindst tre passager (maksimalt 21 dage i kultur), med et synligt fald i migrerende funktioner ved brug af neurosfærer der er blevet passeret en større number gange. Dette stemmer overens med vores tidligere arbejde viser, at mere langsigtede kulturer ændrer celle kinetik 17.
- Når der vælges en galvanotaxis kammer indeholdende NPC til observation, er det vigtigt at vælge et kammer, hvor neurosfæreceller afledte celler er dissocieret og for at muliggøre nøjagtige kinematiske analyser. Hvis neurosfærer ikke er dissocieret godt (NPC er klæbet til hinanden og kan ikke afgrænses), vil analyse af individuel celle vandrende adfærd bliver næsten umuligt. Kulturerne bør have mere tid til at dissociere før observation. Derudover kan celler, der er i umiddelbar nærhed af hinanden fysisk hindrer migrering af naboceller. Vores analyser har vist, at celler anbragt mindst en celle krop væk fra den nærmeste nabocelle migrere til væsentligt større hastigheder end celler, der er grupperet sammen nær midten af den dissocierede neurosfæren, om end med lige directedness.
- Hvis der er en overflod af processer, der strækker sig fra NPC, er dette et tegn på, at cellerne er begyndt at differentiere og de er derfor ikke en ægte repræsentation af en udifferentieret population. En fordel ved fremstilling af galvanotaxis kamre i tre eksemplarer, er, at de resterende to kamre, som ikke blev udvalgt til time-lapse billeddannelse kan fastgøres umiddelbart efter inkuberet plating periode (Trin 2,16), og immunfarvet at kontrollere differentiering profil af cellerne.
- For at opnå optimale resultater dyrkningsmedierne skal være frisklavet og suppleret på hver dag, at det er påkrævet.
- De time-lapse billeder og efterfølgende kinematiske analyser er meget følsomme over for forstyrrelse af prøven. Den live-cell imaging mikroskop bør placeres på en luft bordet for at minimere vibrationer, og systemet må ikke forstyrres under eksperimenter.
Vores lab rutinemæssigt billeder NPC galvanotaksen for 6-8 timer, selv om op til 15-hr Der er foretaget. I løbet af de 15-hr perioder, faldt dcEF tværs af kammeret fra 250 mV / mm til 227 mV / mm (9,2% fald). Længere imaging perioder uundgåeligt ændre pH i medierne i kammeret, hvilket yderligere modificere det elektriske felt. Således anbefales det at udskifte mediet omtrent hver 6 timer. Imidlertid har vi foretaget 8-hr NPC galvanotaxis assays uden udskiftning af medier og har ikke observeret nogen mærkbar celledød (døde celler ikke migrerer) eller fald i cellemotilitet, cellerne opretholder deres hastighed migration hele forsøget. Investigator kan også reducere dybden af kammeret for at øge stabiliteten af dcEF 10.
Efter billeddannelse, er encellede kinematisk sporing analyse udført på en delmængde af de afbildede celler under anvendelse Zeiss AxioVision softwarens sporing modul. Celler udvælges til analyse, hvis de er lokaliseret tættere på kanten afden dissocierede neurosfæren og mindst en celle er adskilt fra den nærmeste celle. Begrundelsen for dette er at minimere sandsynligheden for celler, der overlapper hinanden under sporing, hvilket ville gøre sporing af individuelle celler næsten umuligt. Vi analyserer de følgende fire parametre ved migration:
- X-aksen forskydning - den afstand en celle vandrer i retning af aksen, der er parallel med retningen af dcEF.
- Velocity - den lineære afstand mellem oprindelige og endelige celle positioner divideret med den forløbne tid.
- Rettethed - x-aksen forskydning divideret med den lineære afstand mellem de første og endelige celle positioner.
- Snoning - den samlede vej afstand, cellen divideret med den lineære afstand mellem oprindelige og endelige celle positioner.
De to sidstnævnte parametre er indikatorer for, hvordan lige migrationsforløbet er i en bestemt retning.
18. Et passende substrat og dyrkningsmedium vil skulle udvælges til andre celletyper, og varigheden af cellepodning forud for billeddannelse bør justeres efter behov. Især kan dimensionerne af kammeret skal ændres afhængigt af tykkelsen af det væv, der undersøges (for eksempel hvis et væv skive anbringes i kammeret). Investigator bør huske på that for et sæt elektrisk felt, strømmen gennem kammeret er direkte proportional med tværsnitsarealet af kammeret, og således store udvidelser til kammerets dimensioner kan medføre øget Joule-opvarmning-relateret celledød.
De teknikker, der er beskrevet i denne rapport, giver et stærkt værktøj til at undersøge den vigtige, men ikke bredt undersøgt, fænomenet galvanotaxis. Cellers evne til at reagere på dcEFs har direkte terapeutiske implikationer. Elektrisk stimulering (deep brain stimulation) har allerede vist sig anvendelige i behandlingen af Parkinsons sygdom, og har vist sig at fremme hippocampus neurogenese i en musemodel 19,20. En fuldstændig forståelse af de cellulære mekanismer, der er ansvarlige for dcEF transduktion ind cellulære motilitet kan med tiden føre til anvendelsen af elektrisk stimulation som en klinisk middel til forbedring og dirigere endogen precursor migration til steder med skade eller disease at lette reparationsprocessen. De ovenfor beskrevne fremgangsmåder tilvejebringe en enkel og robust måde at undersøge disse processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (tilskud # 249.669, og # 482.986) og Heart and Stroke Foundation of Canada (tilskud # 485.508). Forfatterne takker Youssef El-Hayek og Dr. Qi Wan for deres assistance i udviklingen af forsøgsprotokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
