Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Summary

Metodi per purificare il colesterolo vincolante tossina streptolisina O ricombinante da

Abstract

Tossine batteriche legano al colesterolo nelle membrane, formando pori che permettono la fuoriuscita di contenuto cellulare e afflusso di materiali dall'ambiente esterno. La cella può recuperare da questo insulto, che richiede processi di riparazione membrane attive, oppure muoiono a seconda della quantità di esposizione tossina e tipo cellulare ^1. Inoltre, queste tossine indurre forti risposte infiammatorie in host infetti attraverso l'attivazione di cellule immunitarie, compresi i macrofagi, che producono una matrice di citochine pro-infiammatorie ^2. Molti batteri Gram-positivi producono colesterolo vincolante tossine che hanno dimostrato di contribuire alla loro virulenza attraverso meccanismi in gran parte non ancora caratterizzati.

Alterazioni morfologiche della membrana plasmatica di cellule esposte a tali tossine includere il sequestro in colesterolo arricchiti protuberanze superficiali, che può essere versato nello spazio extracellulare, suggerendo una difesa intrinseca cellulareMeccanismo ^3,4. Questo processo si verifica in tutte le cellule in assenza di attività metabolica, e possono essere visualizzati utilizzando EM dopo ⁴ chimica fissazione. In cellule immunitarie quali macrofagi che mediano l'infiammazione in risposta all'esposizione tossina, vescicole di membrana indotte sono suggeriti per contenere citochine della famiglia IL-1 e può essere responsabile sia spargimento tossina e diffondere queste citochine pro-infiammatorie ^5,6,7. Un collegamento tra IL-1β rilascio e un tipo specifico di morte cellulare, pyroptosis chiamato è stato suggerito, in quanto entrambi sono processi caspasi-1 ⁸ dipendenti. Per risolvere la complessità di questa risposta dei macrofagi, che comprende vincolante tossina, spargimento di vescicole di membrana, rilascio di citochine, e la morte delle cellule potenzialmente, abbiamo sviluppato le tecniche di etichettatura e metodi di microscopia a fluorescenza che consentono la visualizzazione in tempo reale della tossina cellule interazioni, tra cui misurazioni di disfunzioni e morte (Figura 1). Utilizzaredi imaging cellulare dal vivo è necessario a causa di limiti di altre tecniche. Approcci biochimici non possono risolvere effetti che si verificano in cellule individuali, mentre citofluorimetria non offre alta risoluzione, visualizzazione in tempo reale delle singole celle. I metodi qui descritti possono essere applicati ad analisi cinetica delle risposte indotte da altri stimoli implicano complesse variazioni fenotipiche nelle cellule.

Protocol

1. Purificazione di streptolisina O (SLO)

1. Inoculare 20 ml di coltura overnight cellule BL21 ORO contenenti plasmide pBADgIII-SLOhis ⁹ in 0,5 L di brodo LB e aggiungere 500 microlitri 50 mg / ml ampicillina. Agitare coltura a 225 rpm a 37 ° C fino a OD ₆₀₀ = 0,6, di solito ~ 1,5 hr. Centrifugare 1 batteri ml (considerato T ₀₎ a 10.000 xg 5 minuti, sciogliere pellet in 140 microlitri 1x tampone campione SDS / 1 OD e sonicare al DNA di taglio per l'analisi delle proteine ​​purezza.
2. Indurre i batteri con l'aggiunta di 5 ml arabinosio 20% alla cultura, agitare a 225 rpm a temperatura ambiente per 3 ore. Raccogliere 1 ml di batteri, centrifugare e sciogliere in 1x tampone campione SDS come sopra, per T _{a 3} punti il tempo per l'analisi della purezza.
3. Raccogliere i batteri rimasti in flacone da 500 ml centrifuga, spin 12.000 xg per 12 min a 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 rotore). Decantare il surnatante, negozio di pellet a -80 ° C per una notte o più a lungo se necessario.
4. Risospendere il frozen pellet su ghiaccio in 10 ml Lyse / tampone di lavaggio (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0) supplementato con 400 microlitri 25% Triton X-100, 100 pl 100 mg / ml lisozima, 50 200 microlitri fenilmetilsulfonil fluoruro mM (PMSF). Trasferire il sedimento risospeso a 50 ml di tubo di Oak Ridge.
5. Sonicare lisato 5 volte per 30 secondi su ghiaccio con intervalli di 30 sec. Spin sonicata lisato in tubo di Oak Ridge a 39000 xg per 20 minuti a 4 ° C (18.000 min Sorvall SS-34 rotore).
6. Mentre il lisato è in rotazione, lavare 1 ml Ni-NTA agarosio con 10 ml Lyse / tampone di lavaggio e centrifugare a 1200 rpm per 5 min a 4 ° C. (Tutti gli altri lavaggi / eluizioni utilizzare la centrifugazione in queste condizioni). Aspirare lavare.
7. Aggiungi surnatante batterica dal punto 1.5 a Ni-NTA agarosio, agitare delicatamente per 2,5 ore a 4 ° C. Spin per raccogliere il supernatante. Unire 30 ml di surnatante con 10 μ 4x tampone campione SDS e risparmiare per l'analisi della purezza. Lavare le perline 4 volte in Lyse / Tampone di lavaggio ece in Tris / sale tampone (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluire 3 volte aggiungendo 1 ml di tampone di eluizione (250 mM imidazolo in tampone Tris / sale buffer) e 5 microlitri 1 M ditiotreitolo (DTT) a perline, incubare su ghiaccio per 10 min, filatura e raccogliere il surnatante. SLO è molto redox-sensibili proteine, e deve essere tenuta in ghiaccio in ogni momento. Una volta ridotta, la proteina si perde rapidamente la sua attività se riscaldato a 37 ° C, anche per un breve periodo di tempo.
9. Lavare 500 pl polimixina-coniugato agarosio in tampone di eluizione, centrifugare a 10.000 xg per 1 min a 4 ° C e risospendere in 500 microlitri. Per esaurire endotossina, aggiungere 200 biglie pl ad ogni eluizione e agitare 4 ° C per 30 min. Centrifuga a 10.000 xg per 1 min a 4 ° C, e salvare il surnatante. Combinare 30 microlitri di ogni eluizione con 10 microlitri 4x tampone campione SDS per analisi SDS-PAGE.
10. Verificare la purezza eluizioni mediante SDS-PAGE. Campioni bollire salvate per analisi di gel a 95 ° C per 5 min e 10 pl di carico su un gel al 10%. Stain gel con Coomassie per visualizzare proteina (Figura 2A). SLO è di 69 kDa. Eseguire un saggio Bradford per determinare la concentrazione della proteina (resa tipica è di 4 mg / ml per i primi due eluizioni, ma può variare da ceppo batterico e plasmide usato).
11. Testare l'attività emolitica di ogni eluizione (vedi sotto). Eluizioni piscina dove l'attività di purezza, concentrazione e emolitica sono soddisfacenti. SLO Aliquotare in monouso aliquote (pl tipicamente 5-10), in ghiaccio secco congelare e conservare a -80 ° C.

2. Saggio emolitica

1. Lavare eritrociti di pecora (RBC) in tampone RBC Assay (0,3% di sieroalbumina bovina (BSA), 2 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugare a 1200 rpm per 5 min, e risospendere al 2,5% in RBC 10 ml tampone del saggio RBC.
2. Aggiungere 10 microlitri tampone di saggio RBC / pozzetto in 96 pozzetti V-parte inferiore piastra su ghiaccio. Serialmente diluire ogni eluizione in duplicato. Campi di diluizione tipici sono 1:1.000 a 1:512,000. Include 3 pozzi senza tossina e 3 pozzi con 10microlitri 2% Triton X-100 come pozzi minimo e massimo, rispettivamente.
3. Coprire la piastra ed incubare a 37 ° C 30 min. Centrifugare a 1200 rpm per 5 min. Trasferire 70 ml di surnatante in un fondo piatto da 96 pozzetti. Leggi A _405. Una unità è la diluizione della tossina necessaria per il 50% di lisi dei globuli rossi. Attività di tossina è 1 unità * diluizione factor/0.01 ml.

3. Cella saggio litico

1. Cellule Harvest, conteggio, spin. Risospendere a 2x10 ⁶ / ml in tampone di R / B (RPMI con 2 mM CaCl _2, 0,5% BSA) e 20 ug / ml di ioduro di propidio. Aggiungere 100 ul di cellule a 96 pozzetti V-piastra inferiore.
2. Diluire serialmente SLO a 2x concentrazione finale in tampone R / B, aggiungere 100 microlitri tossina o 100 microlitri di buffer R / B per le cellule. Incubare 5 min 37 ° C. Distanza tipica finale concentrazioni da 2.000 U / ml a 31,25 U / ml.
3. Eseguire le cellule al citofluorimetro e raccogliere i dati con filtri per ficoeritrina (PE). Un'unica log turno rappresenta cel transitoriamente permeabilizzateLS mentre un 3 turni registro indica le cellule morte ^4. Calcolare la lisi specifica delle cellule sottraendo la percentuale di cellule morte nel controllo (% PI ^alta _ctl) dalla _(exp% PI ^alta) sperimentale, come segue: lisi specifica = (% _exp PI ^alta -% PI ^alta _ctl) / (100 -% PI ^alta _ctl) * 100

4. Micropipetta Consegna di tossina di cellule in coltura

1. Un giorno prima dell'esperimento, piastra 2x10 ⁵ macrofagi in un collagene rivestito con fondo di vetro piastra da 35 mm.
2. Accendere il microscopio e microiniettore. Lasciare il tempo per riscaldarsi fase riscaldata a 37 ° C. La scelta del microscopio dipende di solito su ciò che è localmente disponibile. Il microscopio richiede una fase invertita, una fase in grado di riscaldare i piatti a 37 ° C, eccitazione / emissione cubi filtro appropriato per il colorante scelto, e lo spazio collegare fisicamente il microiniettore. Una lente Bertrandè utile per microiniezione, ma non obbligatorio. Il computer guida il microscopio ha bisogno di memoria sufficiente per raccogliere e memorizzare i dati.
3. Cellule etichette per 30 minuti con la tintura a 37 ° C. A seconda del dosaggio, etichettatura può essere fatto con 5 Fura2 pl AM in 1 ml di PBS o 2 microlitri calceina AM in 1 ml mezzi completi. Per Fura2, eccitazione / emissione viene raccolta per 340/510 nm e 380/510 nm, e il rapporto di 340/380 determina segnali flusso di calcio. Per calceina, eccitazione / emissione è 495/515 nm, mentre etidio omodimero è da 525/620 nm e APC è 650/660 nm. Etichette possono essere scelti altri pure.
4. Lavare le cellule con PBS e posto in 1 ml RPMI supplementato con 2 mM CaCl _2. Montare il microscopio.
5. Diluire tossina e destrano in acqua, e centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C. Tipicamente, 1 pl SLO e 4 microlitri 10 mg / ml destrano-555 viene diluito in acqua 6 microlitri. Destrano fluorescente o un'altra fase fluida molecola viene utilizzato per verificare che il femto-punta non è ostruito, e injects come desiderato.
6. Caricare femto-punta dalla parte posteriore con 0,07 ml di tossina diluito utilizzando un Microloader.
7. Caricare femto-punta su microiniettore. Regolare l'angolo di iniettore in modo che la punta si siede sul centro delle cellule con spazio per muoversi in tutte le direzioni. Cancella z-limite. Impostazioni di iniezione devono essere iniezione per 0,5 secondi a 120 psi a 20 psi di pressione posteriore. Abbassare punta fino a quando non entra nel terreno.
8. Utilizzando la lente di Bertrand, centro della punta e seguire la punta come viene abbassato più vicino alle cellule. Una volta perdere la concentrazione, tornare a ottiche normali. L'ombra ago deve essere evidente nel campo. Concentrarsi sopra le celle e abbassare l'ago finché non è a fuoco. Concentrarsi indietro sulle cellule e accuratamente portare l'ago adiacente a una cella. Impostare il z-limite per l'iniezione. Iniziare immagini, spostare punta nella posizione desiderata, iniettare la tossina di rilasciare al punto di tempo desiderato. Sollevare l'ago, passare a una nuova regione di celle e iniettare. Spostare l'ago alla posizione iniziale per evitare indesiderateperdite tossina dall'ago.

Representative Results

Tipicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO può essere ottenuta con una concentrazione proteica di 4 mg / ml. La quantità di tossina necessaria per lisi cellulare varia con il tipo cellulare, ma di solito è 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipi di cellule, come macrofagi può essere più resistenti (4000 U / ml) se altri (linee cellulari T specialmente) sono più sensibili. Queste sensibilità corrispondono SLO disponibile in commercio. Tossina attività diminuisce di circa 2 volte con ogni congelamento-scongelamento, saggi così emolitiche con ciascun lotto o disgelo della tossina sono necessarie per verificare l'attività della tossina. Tossina è anche molto sensibile al calore e all'ossidazione ¹⁰ in assenza di colesterolo contenenti membrane, così è necessario prestare attenzione quando si lavora con la proteina.

Microdelivery della tossina permette il confronto delle cellule non trattate con tossina cellule trattate nello stesso piatto. Esso fornisce anche un controllo interno all'attività tossina, poiché un gradiente di diffusione sarà istiblicato dalla punta micropipetta. Regioni vicine alla micropipetta mostrerà la morte cellulare, caratterizzata da perdita di calceina e l'assorbimento omodimero etidio, mentre le regioni più lontane dalla punta mostrerà alcun danno (Figura 3). Data la potenza della tossina utilizzata, piccole quantità che fuoriescono dalla micropipetta anche in presenza di contropressione può distruggere le cellule come la punta viene spostato lungo il campo (Figura 3). Utilizzando l'opzione di sicurezza sul microiniettore evita questa perdita.

Microdelivery della tossina permette anche l'esame di eventi in tempo reale, come flusso di calcio (Figura 4). Questo flusso non può essere osservato in cellule fisse, e la erogazione localizzata della tossina consente di studiare come questo flusso di calcio indotta si propaga attraverso una coltura cellulare. Bisogna fare attenzione a non danneggiare le cellule con la stessa micropipetta, in quanto questo può anche indurre il calcio di flusso ^11.

Inoltreallo standard a grande campo microscopia, Microdelivery può essere combinato con la microscopia confocale ad alta velocità 3D. Il vantaggio di un microscopio confocale più ampio campo è la capacità di risolvere eventi nel z-dimensione e analizzare singoli piani. Con le tecnologie attuali, uso di un microscopio confocale disco rotante è necessario per raggiungere alte velocità necessarie. Questi vantaggi consentono la visualizzazione di microparticelle viene versato da cellule dendritiche dopo iniezione tossina (Figura 5). Queste microparticelle sono capannone come parte del processo di riparazione cellulare ^4. Molecole di tossina sono concentrate sulle vesciche, che sono sparsi per eliminare tossine ^4. Senza confocale, rilevando le microparticelle sarebbe difficile, e potenzialmente portano alla conclusione che la tossina non viene eliminato in questo modo.

Figura 1. Globaleflusso di lavoro per la generazione e l'utilizzo tossine in imaging cellulare dal vivo. Tossina viene purificato, sottoposto al controllo qualità rigorose, e quindi fornito attraverso micropipetta di cellule che sono state precedentemente etichettati con coloranti vitalità, indicatori di calcio o anticorpi per le proteine ​​di superficie. I dati vengono acquisiti sul microscopio e poi analizzati utilizzando il software, come Metamorph o elementi.

Figura 2. Controllo di qualità dei purificato SLO. (A) I campioni di batteri prima (T ₀₎ e dopo (T ₃₎ induzione tossina, supernatante purificazione seguente (S), e ciascuna delle tre eluizioni (E _{1-E 3)} sono stati risolti tramite SDS-PAGE e colorati con blu Coomassie . (B) O dendritico D2 linea cellulare di leucemia o linea cellulare T27A sono stati stimolati con varie concentrazioni di SLO per 5 min a 37 ° C in presenza di ioduro di propidio eesaminati mediante citometria di flusso. La lisi specifica è stata determinata mediante la seguente formula: lisi specifica = (% _exp PI ^alta -% PI ^alta _ctl) / (100 -% PI ^alta _ctl) * 100

Figura 3. Morte cellulare dimostrato dalla perdita di segnale calceina e l'assorbimento di EtBr nei fibroblasti cutanei umani dopo l'esposizione localizzata alle tossine batteriche anthrolysin O. I fibroblasti sono stati incubati con calceina AM e etidio omodimero utilizzando un kit vivono i morti da Life Technologies. 100 pg del colesterolo legame tossina anthrolysin O ¹³ (un dono di Riposo Dr. Richard, Drexel University) è stato consegnato dalla micropipetta al centro del piatto cultura e widefield immagini di fluorescenza raccolti utilizzando un obiettivo 40x dopo 30 min. Immagini da più campi sono stati combinati per generare l'immagine in formato grande dimostrata utilizzando Metamorfo.

Figura 4. Ingresso di calcio nel citosol di cellule dendritiche umane esposte al SLO tossina batterica. Le cellule sono state caricate con fura2 AM prima della consegna di una soluzione di SLO ad una concentrazione di 80 U / microlitro e una portata di 1 nl / min. La punta della micropipetta per la consegna è indicata al tempo 0 da un asterisco giallo. Le immagini sono state raccolte in modo continuo widefield a lunghezze d'onda 340 e 380 nm di eccitazione, e il rapporto delle emissioni per determinare i livelli di calcio citosolico. Spostamento dal verde al blu pseudocolori indica un aumento dei livelli di calcio citosolico. Il marchio di tempo in ogni pannello indica i secondi dopo l'inizio aggiunta di tossina. Barra di scala è di 20 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Rilascio di microvescicole dalla superficie delle cellule dendritiche esposte a SLO. Le cellule sono state pre-incubate con anti-CD11c coniugato APC etichettare la membrana plasmatica, seguita da consegna di un bolo di 3x10 ^-3 U di SLO. 3-D ricostruzioni stati generati da confocali z-stacks raccolti ad ogni tempo indicato in minuti. La punta del microiniettore è stato identificato utilizzando l'imaging DIC ed è indicata dalla freccia gialla. Barra di scala è di 20 micron.

Discussion

Le tecniche qui descritte consentono l'esame delle risposte delle cellule immunitarie di tossine batteriche. La fase più critica è la manipolazione e somministrazione della tossina. Attività tossina può essere estremamente variabile, anche tra differenti aliquote del preparato stesso, per la sua fragilità. Ciò richiede sia la prova di ogni aliquota di tossina contro una linea cellulare di riferimento o globuli rossi o utilizzando gradienti tossina. Gradienti di tossina, come espresso dal micropipetta, permettono l'intero spettro di tossine indotte attività da osservare in tempo reale, ma non si presta ad analisi biochimiche.

Consegna Micropipetta della tossina può essere impegnativo. Diversamente microiniezione standard, tuttavia, la penetrazione della cella non è richiesto per questo dosaggio. Infatti, bisogna fare attenzione a non danneggiare le cellule con la stessa dell'ago, poiché questo suscitare una simile risposta di riparazione membrana ^12. In cellule immunitarie, in particolare, i flussi di calcio generati daago contatto si propagano attraverso i nanotubi ad altre celle all'interno della cultura ^11. Non iniettare cellule anche estendere la durata dell'ago. Analogamente, l'uso di una lente Bertrand seguire discesa dell'ago alle cellule rimuove incertezze nel posizionamento della micropipetta. Anche se gli aghi danneggiati perderà tossina più rapidamente aghi intatti, essi possono ancora essere utilizzati per generare i risultati preliminari. Il sistema consente microiniettore iniezioni multiple, un gradiente tossina dovrebbe essere superiore desiderata. In alternativa, la durata dell'iniezione può anche essere modificato per alterare la dose erogata. Il microiniettore permette anche esperimenti più essere eseguita in un piatto. Inoltre, l'effetto di reinfestazione può essere studiato. Sebbene si descrive esperimenti esaminando cellule immunitarie, questi metodi possono essere adattati ad altre linee cellulari pure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.