Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Summary

Metoder for å rense kolesterol bindende toksin streptolysin O fra rekombinant

Abstract

Bakterielle giftstoffer binder seg til kolesterol i membraner, forming porene som tillater lekkasje av mobilnettet innhold og tilstrømningen av materialer fra det ytre miljø. Cellen kan enten komme fra denne fornærmelse, som krever aktive membran reparasjonsprosesser, ellers dø avhengig av mengden av toksin eksponering og celletype ^en. I tillegg er disse toksiner indusere sterke inflammatoriske responser i infiserte verter gjennom aktivering av immunceller, inkludert makrofager, som produserer en rekke pro-inflammatoriske cytokiner ^2. Mange grampositive bakterier produserer kolesterol bindende giftstoffer som har vist seg å bidra til virulens deres gjennom hovedsak uncharacterized mekanismer.

Morfologiske endringer i plasmamembranen av celler eksponert for disse toksiner inkluderer deres håndtering i kolesterol-beriket overflate fremspring, som kan utskilles i det ekstracellulære rom, tyder på en iboende cellulær forsvarmekanismen ^3,4. Denne prosessen skjer på alle celler i fravær av metabolsk aktivitet, og kan bli visualisert med EM etter kjemisk fiksering ^4. I immunceller slik som makrofager som medierer inflammasjon som svar på toksin eksponering, induseres membranvesikler foreslo å inneholde cytokiner av IL-1-familien, og kan være ansvarlig for både shedding toksinet og spre disse pro-inflammatoriske cytokiner ^5,6,7. En kobling mellom IL-1β utgivelse og en bestemt type celledød, har kalt pyroptosis blitt foreslått, som begge er caspase-1 avhengige prosesser ^8. Å sortere ut kompleksiteten i dette makrofag respons, som inkluderer toksin bindende, Shedding av membranvesiklene, cytokine release, og potensielt celledød, har vi utviklet merking teknikker og fluorescens mikroskopi metoder som tillater for sanntids visualisering av toksin-celle interaksjoner, inkludert målinger av dysfunksjon og død (figur 1). Brukav levende celle bildebehandling er nødvendig på grunn av begrensninger i andre teknikker. Biokjemiske metoder kan ikke løse effekter som oppstår i enkelte celler, mens flowcytometri ikke tilbyr høy oppløsning, sanntids visualisering av individuelle celler. Fremgangsmåtene beskrevet her kan brukes til kinetisk analyse av responser indusert av andre stimuli involverer komplekse fenotypiske endringer i celler.

Protocol

1. Rensing av Streptolysin O (SLO)

1. Inokulere 20 ml over natten kultur av BL21 GOLD celler inneholdende pBADgIII-SLOhis plasmid ⁹ inn 0,5 L LB-næringsløsning og tilsett 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Rist kultur ved 225 rpm ved 37 ° C inntil OD ₆₀₀ = 0,6, vanligvis ~ 1,5 hr. Sentrifuger 1 ml bakterier (vurderes T ₀₎ på 10.000 xg 5 min, oppløse pellet i 140 ul 1x SDS sample buffer / 1 OD og sonicate å klippe DNA for protein renhet analyse.
2. Induser bakterier med tilsetning av 5 ml 20% arabinose til kultur, riste ved 225 opm ved romtemperatur i 3 timer. Samle 1 ml bakterier, sentrifuger og oppløses i 1x SDS prøvebuffer som ovenfor for T ₃ tid punkt for renhet analyse.
3. Samle gjenværende bakterier i 500 ml sentrifuge flaske, spinne 12.000 xg i 12 min ved 4 ° C (8500 rpm Sorvall GS-3 rotor). Dekanter supernatanten, butikk pellet ved -80 ° C over natten eller lenger om nødvendig.
4. Resuspender frOzen pellet på isen i 10 ml Lyse / Vaskebuffer (50 mM NaH _{2 4} PO, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) supplementert med 400 pl 25% Triton X-100, 100 pl 100 mg / ml lysozym, 50 pl 200 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF). Overfør resuspenderte pellet til 50 ml Oak Ridge tube.
5. Sonicate lysate 5 ganger i 30 sek på isen med 30 sek mellomrom. Spin sonikert lysat i Oak Ridge røret på 39.000 xg i 20 min ved 4 ° C (18 000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
6. Mens lysatet er spinning, vaske en ml Ni-NTA-agarose med 10 ml Lyse / vaskebuffer og sentrifugering ved 1200 opm i 5 minutter ved 4 ° C. (Alle videre vasker / elutions bruke sentrifugering under disse forholdene). Aspirer vaske.
7. Legg bakteriell supernatant fra trinn 1,5 til Ni-NTA agarose, rist forsiktig for 2,5 timer ved 4 ° C. Spinn å samle supernatant. Kombiner 30 ul supernatant med 10 μ 4x SDS sample buffer og lagre for renhet analyse. Vask kulene 4 ganger i Lyse / vaskebuffer og påce i Tris / salt buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluere 3 ganger ved å tilsette 1 ml elueringsbuffer (250 mM imidazol i Tris / saltbuffer) og 5 pl 1 M ditiotreitol (DTT) til perler, inkubering på is i 10 min, spinning og samle supernatanten. SLO er en svært redoks-følsomme proteiner, og må holdes på is hele tiden. Gang reduseres, vil proteinet raskt miste sin aktivitet hvis oppvarmet til 37 ° C, selv for en kort periode.
9. Vask 500 pl polymixin-konjugert agarose i elueringsbuffer, spinn ved 10.000 xg i 1 minutt ved 4 ° C og resuspender i 500 pl. Å utarme endotoxin, legg 200 ul perler til hver eluering og rist 4 ° C i 30 min. Spinn ved 10.000 xg i 1 minutt ved 4 ° C, og lagre den overliggende. Kombiner 30 ul av hver eluering med 10 ul SDS 4x prøvebuffer for SDS-PAGE-analyse.
10. Test renhet elutions ved SDS-PAGE. Koke prøvene lagret for gel analyse ved 95 ° C i 5 min og last 10 pl på en 10% gel. Stain gel med Coomassie å visualisere protein (figur 2A). SLO er 69 kDa. Utfør en Bradford Assay å bestemme protein konsentrasjon (typisk utbytte er 4 mg / ml for første to elutions, men kan variere fra bakteriestammen og plasmid brukt).
11. Test hemolytisk aktivitet av hver eluering (se nedenfor). Pool elutions der renhet, konsentrasjon og hemolytisk aktivitet er tilfredsstillende. Delmengde SLO i engangsbeholdere alikvoter (typisk 5-10 ul), fryse på tørris og oppbevar ved -80 ° C.

2. Hemolytisk Assay

1. Vask sheep røde blodceller (RBC) i RBC analysebuffer (0,3% bovint serumalbumin (BSA), 2 mM ₂ CaCl, 10 mM Hepes, pH 7,4), spinn ved 1.200 opm i 5 min, og resuspender i 2,5% RBC i 10 ml RBC analysebuffer.
2. Tilsett 10 pl RBC analysebuffer / brønn i 96-brønns V-bunnplaten på isen. Serielt fortynne hver eluering i to eksemplarer. Typiske fortynning områder er 1:1.000 til 1:512,000. Inkluderer 3 brønner uten gift og 3 brønner med 10pl 2% Triton X-100 som minimum og maksimum brønner, henholdsvis.
3. Dekkplate og inkuber ved 37 ° C 30 min. Sentrifuger ved 1200 rpm i 5 min. Overfør 70 ul supernatant til en flat bunn 96 brønns plate. Les A _405. En enhet er fortynningen av toksin nødvendig for 50% lyse av RBCs. Toksin aktivitet er en enhet * fortynning factor/0.01 ml.

3. Cell lytisk Assay

1. Høste celler, telle, spinn. Resuspender ved 2x10 ⁶ / ml i buffer R / B (RPMI med 2 mM CaCl _2, 0,5% BSA) og 20 pg / ml propidium jodid. Legg 100 ul celler til en 96-brønns V-bunnplaten.
2. Serielt fortynne SLO til 2x endelig konsentrasjon i buffer R / B, tilsett 100 ul toksin eller 100 ul buffer R / B til cellene. Inkuber 5 min 37 ° C. Typisk sluttkonsentrasjoner spenner fra 2,000 U / ml til 31,25 U / ml.
3. Kjør celler på strømningscytometeret og samle data med filtre for phycoerythrin (PE). En ett-log skift representerer forbigående permeabilized cells mens en 3 log skift indikerer døde celler ^4. Beregn den spesifikke lysis av cellene ved å trekke prosentandelen av døde celler i kontrollen (% PI ^høy _CTL) fra den eksperimentelle (% PI ^høy _exp), som følger: spesifikk lysis = (% PI ^høy _exp -% PI ^høy _CTL) / (100 -% PI ^høy _CTL) * 100

4. Mikropipette Levering av Toxin til celler i kultur retter

1. En dag før eksperimentere, plate 2x10 ⁵ makrofager på en kollagen-belagt glass-bunn 35 mm parabolen.
2. Slå på mikroskop og microinjector. Tillat oppvarmet stadium tid til å varme til 37 ° C. Valget av mikroskop avhenger vanligvis på hva som er tilgjengelig lokalt. Mikroskopet trenger en omvendt scenen, en scene som kan varme opp retter til 37 ° C, eksitasjon / utslipp filter kuber som passer for fargestoff valgt, og plass til fysisk koble microinjector. En Bertrand objektiver nyttig for mikroinjeksjon, men ikke nødvendig. Datamaskinen kjører mikroskopet må nok minne til å samle inn og lagre data.
3. Produsent celler for 30 min med fargestoff ved 37 ° C. Avhengig analysen, kan merking gjøres med 5 pl Fura2 AM i 1 ml PBS eller 2 ul calcein AM i en ml full media. For Fura2 er eksitasjon / emisjon innsamles 340/510 nm og 380/510 nm, og forholdet mellom 340/380 signaler bestemmer kalsium fluks. For calcein, er eksitasjon / utslipp 495/515 nm, mens Ethidium homodimer er 525/620 nm og APC er 650/660 nm. Andre etiketter kan velges så vel.
4. Vask celler med PBS og sted i 1 ml RPMI supplert med 2 mM CaCl _2. Montere på mikroskop.
5. Fortynn toksinet og dekstran i vann, og sentrifuger ved 20.000 xg 10 min ved 4 ° C. Vanligvis er 1 ul SLO og 4 pl 10 mg / ml dekstran-555 fortynnet i 6 pl vann. Dekstran eller annen fluorescerende væske-fase molekylet brukes til å kontrollere at femto-spissen ikke er tett, og injeCTS som ønsket.
6. Last femto-tips fra baksiden med 0,07 ul utvannet toksin ved hjelp av en microloader.
7. Last femto-tip på microinjector. Juster vinkel injektor slik at spissen vil sitte over sentrum av cellene med plass til å bevege seg i alle retninger. Fjerne z-grensen. Injeksjon innstillinger bør injisere for 0,5 sek på 120 psi med 20 psi mottrykk. Nedre spiss fram til den trer mediet.
8. Bruke Bertrand objektivet, senter spissen og følg spissen når den senkes nærmere cellene. Når du mister fokus, bytte tilbake til normal optikk. Nålen skygge bør være åpenbart i feltet. Fokus ovenfor cellene og senke nålen til den er i fokus. Fokus tilbake på cellene og nøye bringe nålen tilstøtende til en celle. Still z-grensen for injeksjon. Commence bildebehandling, flytt tips til ønsket posisjon, injiserer å frigjøre toksin på ønsket tidspunkt. Hev nålen, flytte til en ny region av celler og injisere. Flytt nålen til startposisjon for å hindre uønskettoksin lekkasje fra nålen.

Representative Results

Typisk 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO kan oppnås med en proteinkonsentrasjon på 4 mg / ml. Mengden av toksin kreves for cellelyse varierer etter celletype, men er vanligvis 125 til 500 U / ml SLO (figur 2B). Celletyper som makrofager kan være mer motstandsdyktig (4000 U / ml) skjønt andre (spesielt T-cellelinjer) er mer følsomme. Disse sensitiviteter samsvarer med kommersielt tilgjengelig SLO. Toksin aktivitet reduserer omtrent to ganger med hver fryse-tine, så hemolytiske analyser med hvert parti eller tine av toksin for å bekrefte toksin aktivitet. Toksinet er også meget følsom for varme og oksydasjon ¹⁰ i fravær av kolesterol-holdige membraner, så må man være forsiktig når man arbeider med proteinet.

Microdelivery av toksinet tillater sammenligning av ubehandlede celler med toksin-behandlede celler i samme form. Det gir også en intern kontroll for toksin aktivitet, siden en diffusjon gradient blir etablert fra micropipette tips. Regioner nær til mikropipette viser celledød, preget av calcein tap og Ethidium homodimer opptak, mens regionene lenger bort fra spissen vil vise ingen skader (Figur 3). Gitt styrkegraden av toksinet brukes, kan små mengder som lekker fra mikropipette selv i nærvær av mottrykket ødelegge celler som spissen beveges langs feltet (Figur 3). Bruke sikkerhet alternativet på microinjector vil unngå dette tapet.

Microdelivery av toksinet kan også undersøkelse av hendelser i sanntid, for eksempel kalsium flux (figur 4). Denne fluks kan ikke observeres i faste celler, og den lokaliserte produksjonstid av toksinet tillater studier av hvordan denne indusert kalsium fluks er overført gjennom en cellekultur. Care må tas for ikke å skade cellene med micropipette selv, da dette kan også forårsake kalsium flux ^11.

I tilleggtil standard brede felt mikroskopi, kan microdelivery kombineres med høy hastighet 3D konfokalmikroskopi. Fordelen med en konfokal mikroskop over et vidt felt er evnen til å løse hendelser i z-dimensjonen, og analysere individuelle fly. Med dagens teknologi, er bruk av en roterende plate konfokal nødvendig for å oppnå de høye hastigheter som trengs. Disse fordelene tillate visualisering av mikropartikler blir skur fra dendrittiske celler etter toksin injeksjon (figur 5). Disse mikropartiklene skur som en del av den cellulære reparasjonsprosessen ^4. Toksin molekyler er konsentrert om blebs, som kaster å eliminere giftstoffer ^4. Uten konfokal avbildning ville detektere mikropartiklene være vanskelig, og føre til den konklusjon at toksinet ikke elimineres på denne måte.

Figur 1. Totaltarbeidsflyt for å generere og utnytte giftstoffer i levende celle bildebehandling. Giften er renset, utsatt for streng kvalitetskontroll, og deretter levert via mikropipette til celler som tidligere har blitt merket med levedyktighet fargestoffer, kalsium indikatorer eller antistoffer til overflateproteiner. Data er ervervet på mikroskopet og deretter analysert ved hjelp av programvare, for eksempel MetaMorph eller Elements.

Figur 2. Kvalitetskontroll av renset SLO. (A) Eksempler på bakterier før (T ₀₎ og etter (T ₃₎ toksin induksjon, supernatanten følgende rensing (S), og hver av tre elutions (E _{1-E 3)} ble løst ved SDS-PAGE og farget med Coomassie blå . (B) enten dendrittiske cellelinje D2 eller leukemi cellelinje T27A ble utfordret med forskjellige konsentrasjoner av SLO i 5 min ved 37 ° C i nærvær av propidium jodid ogundersøkt ved strømningscytometri. Den spesifikke lysis ble bestemt ved den følgende formel: spesifikk lysis = (% PI ^høy _exp -% PI ^høy _CTL) / (100 -% PI ^høy _CTL) * 100

Figur 3. Celledød vist ved tap av calcein signal og opptak av EtBr i menneskelige dermal fibroblaster etter lokalisert eksponering for bakteriell toksin anthrolysin O. Fibroblaster ble inkubert med calcein AM og Ethidium homodimer bruke en live død kit fra Life Technologies. 100 pg av det kolesterol bindende toksin anthrolysin O ¹³ (en gave fra Dr. Richard Rest, Drexel University) ble levert av mikropipette inn i sentrum av kulturen parabol og Vidvinkelokular fluorescensbilder samles ved hjelp av en 40x objektiv etter 30 min. Bilder fra flere felt ble kombinert for å generere større bilde vises med Metamorph.

Figur 4. Kalsiuminnstrømningen inn cytosol av menneskelige dendrittiske celler eksponert for den bakterielle toksin SLO. Celler ble ladet med fura2 AM før levering av en løsning av SLO ved en konsentrasjon på 80 U / pl og en strømningshastighet på 1 nl / min. Tuppen av mikropipette brukes ved levering er indisert ved tid 0 av en gul stjerne. Bilder ble oppsamlet kontinuerlig i Vidvinkelokular modus ved 340 og 380 nm eksitasjonsbølgelengdene, og forholdet mellom utslipp brukes til å bestemme cytosoliske kalsiumnivå. Skiftet fra grønt til blått PseudoColor indikerer en økning i cytosoliske kalsium. Tiden mark i hvert panel viser sekunder etter starten tillegg av toksin. Skala bar er 20 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Release av microvesicles fra overflaten av dendrittiske celler eksponert til SLO. Celler ble pre-inkubert med anti-CD11c konjugert til APC å merke plasmamembranen, etterfulgt av levering av en bolus av 3x10 ^-3 U av SLO. 3-D rekonstruksjoner ble generert fra confocal z-stabler innsamlet ved hvert tidspunkt er angitt i minutter. Tuppen av microinjector ble identifisert ved hjelp av DIC bildebehandling og er indikert av den gule pilen. Skala bar er 20 mikrometer.

Discussion

Teknikkene som beskrives her la undersøkelse av svarene immunceller til bakterielle giftstoffer. Den mest kritiske trinnet er håndtering og dosering av toksinet. Toksin aktivitet kan være svært variabel, selv mellom forskjellige aliquoter av samme preparatet, på grunn av skjørhet sin. Dette nødvendiggjør enten testing hvert alikvot av toksin mot en referanse cellelinje eller RBCs eller bruker toxin gradienter. Toksin gradienter, som leveres av mikropipette, la hele spekteret av toksin-indusert aktiviteter som skal overholdes i sanntid, men ikke egner seg til biokjemisk analyse.

Mikropipette levering av toksinet kan være utfordrende. I motsetning til standard mikroinjeksjon imidlertid penetrasjon av cellen ikke er nødvendig for denne analysen. Faktisk må man passe på å ikke skade cellene med nålen selv, da dette vil lokke fram en lignende membran reparasjon respons ^12. I immunceller, spesielt, kalsium flukser generert avnålen kontakt vil forplante via nanorør til andre celler i kulturen ^11. Ikke injisere celler vil også forlenge levetiden på nålen. Tilsvarende, fjerner bruk av en Bertrand linsen for å følge nålen nedstigning til cellene en viss usikkerhet i posisjonering av mikropipette. Selv skadede nåler vil lekke toksin raskere enn intakte nåler, kan de likevel brukes til å generere foreløpige resultater. Den microinjector systemet tillater flere injeksjoner, bør en høyere toksin gradient være ønsket. Alternativt kan injeksjon varighet også modifiseres til å endre dosen levert. Den microinjector gir også flere eksperimenter som skal utføres i løpet av en tallerken. Videre kan virkningen av reintroduksjon bli studert. Selv om vi beskrive eksperimenter undersøke immunceller, kunne disse metodene tilpasses andre cellelinjer også.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.