Summary
Los métodos para purificar el colesterol unión toxina estreptolisina O de recombinante
Abstract
Las toxinas bacterianas se unen al colesterol en las membranas, la formación de poros que permiten la fuga del contenido celular y el flujo de los materiales desde el entorno externo. La célula o bien puede recuperarse de este insulto, que requiere procesos activos de reparación de la membrana, o morir en función de la cantidad de exposición a la toxina y tipo de célula 1. Además, estas toxinas inducir fuertes respuestas inflamatorias en los huéspedes infectados a través de la activación de células inmunes, incluyendo los macrófagos, que producen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias 2. Muchas bacterias Gram positivas producir colesterol toxinas vinculantes que se ha demostrado que contribuyen a su virulencia a través de mecanismos en gran medida no caracterizadas.
Cambios morfológicos en la membrana plasmática de las células expuestas a estas toxinas incluyen su secuestro en salientes superficiales enriquecidos en colesterol, que puede liberarse en el espacio extracelular, lo que sugiere una defensa celular intrínsecamecanismo de 3,4. Este proceso se produce en todas las células en ausencia de actividad metabólica, y puede ser visualizado usando EM después de 4 fijación química. En las células inmunes, tales como macrófagos, que median la inflamación en respuesta a la exposición a la toxina, inducidos vesículas de membrana se sugieren para contener las citoquinas de la familia IL-1 y puede ser responsable tanto por derramar la toxina y la difusión de estas citoquinas pro-inflamatorias 5,6,7. Un enlace entre la IL-1β de liberación y un tipo específico de la muerte celular, denominado pyroptosis ha sugerido, ya que ambos son procesos que dependen de la caspasa-1 8. Para resolver la complejidad de esta respuesta de los macrófagos, que incluye la unión toxina, el desprendimiento de las vesículas de membrana, la liberación de citoquinas, y la muerte potencialmente celular, se han desarrollado técnicas de etiquetado y los métodos de microscopía de fluorescencia que permiten la visualización en tiempo real de las interacciones célula-toxina, incluyendo mediciones de la disfunción y la muerte (Figura 1). Utilizarde imágenes de células vivas es necesario debido a las limitaciones en otras técnicas. Enfoques bioquímicos no puede resolver los efectos que ocurren en células individuales, mientras que la citometría de flujo no ofrece alta resolución, en tiempo real la visualización de células individuales. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a análisis de la cinética de las respuestas inducidas por otros estímulos que implican complejos cambios fenotípicos en las células.
Protocol
1. Purificación de la estreptolisina O (SLO)
- Inocular 20 ml de cultivo durante la noche de células BL21 oro que contenía el plásmido pBADgIII SLOhis-9 en caldo LB 0,5 L y añadir 500 l 50 mg / ml de ampicilina. Agitar cultivo a 225 rpm a 37 ° C hasta OD 600 = 0,6, normalmente ~ 1,5 h. Centrifugar 1 ml de bacterias (considerados T 0) a 10.000 xg 5 min, se disuelve el pellet en 140 l 1x tampón de muestra de SDS / OD 1 y sonicado para ADN de cizallamiento para el análisis de proteínas pureza.
- Inducir bacterias con la adición de 5 ml de 20% de arabinosa a la cultura, agitar a 225 rpm a temperatura ambiente durante 3 h. Recoger 1 ml de las bacterias, se centrifuga y se disuelve en tampón de muestra de SDS 1x como anteriormente para el punto de tiempo T 3 para el análisis de pureza.
- Recoger las bacterias restantes en 500 ml botella de centrífuga, girar 12.000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm Sorvall rotor GS-3). Decantar el sobrenadante, tienda precipitado a -80 ° C durante la noche o más tiempo si es necesario.
- Resuspender el frozen sedimento en hielo en 10 ml Lyse / Tampón de lavado (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) suplementado con 400 l 25% de Triton X-100, 100 l 100 mg / ml de lisozima, 50 l 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir el precipitado resuspendido a 50 ml tubo Ridge, Oak.
- Sonicar lisado 5 veces durante 30 segundos en hielo con intervalos de 30 seg. Centrifugación lisado sonicado en tubo Oak Ridge a 39.000 xg durante 20 min a 4 º C (18.000 rpm Sorvall rotor SS-34).
- Mientras que el lisado está girando, lavar 1 ml de Ni-NTA agarosa con 10 ml Lyse / tampón de lavado y centrifugado a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todos los lavados adicionales / eluciones utilizar centrifugación en estas condiciones). Aspirar lavar.
- Añadir sobrenadante bacteriano procedente de la Etapa 1,5 a Ni-NTA agarosa, agitar suavemente durante 2,5 horas a 4 ° C. Girar para recoger el líquido sobrenadante. Combine 30 l de sobrenadante con 10 μ 4x SDS muestra de amortiguación y ahorrar para el análisis de pureza. Lavar las perlas 4 veces en Lyse / tampón de lavado y ence en Tris / sal tampón (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Eluir 3 veces mediante la adición de 1 ml de tampón de elución (250 mM de imidazol en tampón de Tris / tampón de sal) y 5 l 1 M de ditiotreitol (DTT) a perlas, incubando en hielo durante 10 min, centrifugado y recogiendo el sobrenadante. SLO es una proteína muy sensible a redox, y se debe mantener en hielo en todo momento. Una vez reducida, la proteína perderá rápidamente su actividad si se calienta a 37 ° C, incluso durante un corto período de tiempo.
- Lavar 500 l polimixina-conjugado de agarosa en tampón de elución, centrifugado a 10.000 xg durante 1 min a 4 ° C y se resuspende en 500 l. Para agotar endotoxina, añadir 200 perlas mu l a cada elución y agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugado a 10.000 xg durante 1 min a 4 ° C, y guardar el sobrenadante. Combinar 30 l de cada elución con 10 l de 4x tampón de muestra de SDS para análisis SDS-PAGE.
- Probar la pureza de eluciones por SDS-PAGE. Hervir muestras se guarda para análisis de gel a 95 º C durante 5 min y 10 l de carga en un gel de 10%. Mancha de gel con Coomassie para visualizar las proteínas (Figura 2A). SLO es 69 kDa. Realizar un ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína (rendimiento típico es de 4 mg / ml para dos eluciones primero, pero puede variar según la cepa bacteriana y del plásmido utilizado).
- Prueba de la actividad hemolítica de cada elución (véase más adelante). Eluciones piscina donde la actividad de pureza, concentración y hemolítica son satisfactorios. SLO alícuota en un solo uso alícuotas (l típicamente 5-10), congela en hielo seco y se almacena a -80 ° C.
2. Ensayo hemolítico
- Lavar glóbulos rojos de oveja (RBC) en RBC tampón de ensayo (0,3% albúmina de suero bovino (BSA), 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugado a 1.200 rpm durante 5 min y se resuspenden en 2,5% en los glóbulos rojos 10 ml de tampón de ensayo de RBC.
- Añadir 10 l tampón de ensayo de RBC / pocillo en 96-y V-de la placa inferior en hielo. Diluciones seriadas cada elución por duplicado. Los rangos típicos de dilución son 1:1,000 a 1:512,000. Incluye 3 pozos con ninguna toxina y pozos 3 con 10l 2% de Triton X-100 como pozos mínimo y máximo, respectivamente.
- Cubrir la placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1.200 rpm durante 5 min. Transferir 70 l de sobrenadante a una placa de fondo plano de 96 también. Lea A 405. Una unidad es la dilución de la toxina requerida para un 50% de lisis de los hematíes. Actividad de la toxina es de 1 unidad * dilución factor/0.01 ml.
3. Lítica celular Ensayo
- Cosecha, recuento de células, spin. Resuspender en 2x10 6 / ml en tampón de R / B (RPMI con 2 mM CaCl 2, 0,5% de BSA) y 20 ug / ml de yoduro de propidio. Añadir 100 células mu l a un 96-así fondo en V de la placa.
- Diluir en serie SLO a 2x concentración final en tampón de R / B, añadir 100 l toxina o 100 l tampón de R / B a las células. Incubar 5 min 37 ° C. El rango típico concentraciones finales de 2.000 U / ml a 31,25 U / ml.
- Ejecutar las células en citómetro de flujo y reunir datos con filtros para la ficoeritrina (PE). A cambio de un registro representa cel transitoriamente permeabilizadasls mientras que un cambio de log 3 indica las células muertas 4. Cálculo de la lisis específica de las células restando el porcentaje de células muertas en el control (% PI alta ctl) de la experimental (% exp PI alta), como sigue: lisis específica = (% exp PI alta -% PI alta ctl) / (100 -% PI alta ctl) * 100
4. Micropipetas de entrega de la toxina a las células en placas de cultivo
- Un día antes del experimento, placa de 2x10 5 macrófagos en un colágeno recubierto con fondo de cristal plato de 35 mm.
- Encienda el microscopio y microinyector. Permitir tiempo de la etapa calentada a calentar a 37 ° C. La elección del microscopio por lo general depende de lo que está disponible localmente. El microscopio tiene una fase invertida, una etapa capaz de calentar los platos a 37 ° C, de excitación / emisión cubos de filtros apropiados para el colorante elegido, y el espacio para conectar físicamente el microinyector. Una lente de BertrandEs útil para la microinyección, pero no es obligatorio. El ordenador de conducción del microscopio necesita suficiente memoria para recoger y almacenar datos.
- Marcar células durante 30 minutos con colorante a 37 º C. Dependiendo del ensayo, el etiquetado puede hacerse con 5 Fura2 AM mu l en 1 ml de PBS o 2 l de calceína AM en 1 ml de medio completo. Para Fura2, excitación / emisión es recogida para 340/510 nm y 380/510, y la relación de 340/380 señales determina el flujo de calcio. Para calceína, excitación / emisión es 495/515 nm, mientras que homodímero de etidio es de 525/620 nm y APC se encuentra a 650/660 nm. Otras etiquetas se pueden elegir también.
- Lavar las células con PBS y el lugar en 1 ml de RPMI suplementado con 2 mM CaCl 2. Montar el microscopio.
- Diluir la toxina y dextrano en agua, y se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min 4 º C. Típicamente, 1 l SLO y 4 l 10 mg / ml de dextrano 555-se diluye en 6 l de agua. Dextrano u otra molécula fluorescente en fase líquida se utiliza para verificar que la femto-punta no se ha obstruido, y Injects como se desee.
- Carga de femto-punta por la parte posterior con 0,07 l de la toxina diluida con un microloader.
- Carga de femto-punta en microinyector. Ajustar el ángulo de inyector de manera que la punta se sentará sobre el centro de las células con espacio para moverse en todas las direcciones. Borrar z-límite. Ajustes de inyección deben estar inyectando durante 0,5 segundos a 120 psi con una presión de 20 psi atrás. Baja punta hasta que entra en el medio.
- Uso de la lente de Bertrand, el centro de la punta y el seguimiento de la punta a medida que desciende más cerca de las células. Una vez que se pierde el foco, vuelva a la óptica normal. La sombra aguja debería ser evidente en el campo. Enfoque por encima de las células y bajar la aguja hasta que esté en el foco. Centrarse de nuevo en las células y cuidadosamente llevar la aguja adyacente a una célula. Z Ajuste el límite de la inyección. Comenzar la imagen, mueva la punta a la posición deseada, inyectar a liberar toxinas en el punto de tiempo deseado. Levante la aguja, mueva a una nueva región de las células y se inyecta. Mueva la aguja a la posición inicial para evitar cualquier indeseadotoxina fuga de la aguja.
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Representative Results
Típicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO puede obtenerse con una concentración de proteína de 4 mg / ml. La cantidad de toxina requerida para la lisis celular varía según el tipo de célula, pero generalmente es 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células como los macrófagos pueden ser más resistentes (4000 U / ml), aunque otros (especialmente líneas celulares T) son más sensibles. Estas sensibilidades corresponden con SLO disponible comercialmente. Actividad de la toxina disminuye aproximadamente 2 veces con cada uno de congelación-descongelación, los ensayos para hemolíticas con cada lote o descongelación de la toxina son necesarios para verificar la actividad de la toxina. Toxina es también muy sensible al calor y la oxidación de 10 en ausencia de colesterol que contienen las membranas, por lo que se debe tener cuidado cuando se trabaja con la proteína.
Microdelivery de la toxina permite la comparación de las células no tratadas con toxina tratados con células en el mismo plato. También proporciona un control interno para la actividad de la toxina, ya que un gradiente de difusión será establepublicados desde la punta de la micropipeta. Las regiones cercanas a la micropipeta mostrará la muerte celular, caracterizada por la pérdida de calceína y la absorción de homodímero de etidio, mientras que las regiones más alejadas de la punta se mostrará ningún daño (Figura 3). Dada la potencia de la toxina usada, las pequeñas cantidades que se escapan de la micropipeta, incluso en presencia de presión de retorno puede destruir las células como la punta se mueve a lo largo del campo (Figura 3). Uso de la opción de seguridad de la microinyector evitarán esta pérdida.
Microdelivery de la toxina también permite el examen de eventos en tiempo real, tales como el flujo de calcio (Figura 4). Este flujo no puede ser observado en células fijadas, y la distribución localizada de la toxina permite el estudio de cómo este flujo de calcio inducido se propaga a través de un cultivo de células. Se debe tener cuidado de no lesionar las células con la misma micropipeta, ya que esto también puede inducir flujo de calcio 11.
Ademásestándar para microscopía de campo amplio, microdelivery se puede combinar con alta velocidad de microscopía confocal 3D. La ventaja de un microscopio confocal más amplio campo es la capacidad de resolver los acontecimientos en la dimensión z y analizar los distintos planos. Con las tecnologías actuales, el uso de un disco giratorio confocal es necesario para alcanzar las altas velocidades necesarias. Estas ventajas permiten la visualización de las micropartículas se están desprendiendo de las células dendríticas después de la inyección de toxina (Figura 5). Estas micropartículas se liberan como parte del proceso de reparación celular 4. Moléculas de toxina se concentran en las ampollas, que se desprenden de eliminar toxinas 4. Sin formación de imágenes confocal, la detección de las micropartículas sería difícil, y potencialmente conducir a la conclusión de que la toxina no se elimina de esta manera.
Figura 1. Globalflujo de trabajo para la generación y utilización de toxinas en imágenes de células vivas. Toxina es purificado, sometido a un control de calidad riguroso, y luego entregado a través de micropipeta a células que han sido previamente marcadas con colorantes de viabilidad, indicadores de calcio o anticuerpos para proteínas de superficie. Los datos se adquieren en el microscopio y luego analizados mediante el software, tales como Metamorph o elementos.
Figura 2. El control de calidad de SLO purificada. (A) las muestras de bacterias antes (T 0) y después (T 3) inducción de la toxina, la purificación del sobrenadante después de la (S), y cada uno de tres eluciones (E 1-E 3) se resolvieron mediante SDS-PAGE y teñido con azul de Coomassie . (B) o bien D2 línea celular dendrítica o línea celular de leucemia T27A fueron desafiados con diversas concentraciones de SLO de 5 min a 37 ° C en presencia de yoduro de propidio yexaminaron por citometría de flujo. La lisis específica se determinó mediante la siguiente fórmula: lisis específica = (% exp PI alta -% PI alta ctl) / (100 -% PI alta ctl) * 100
Figura 3. La muerte celular se muestra por la pérdida de la señal de captación de calceína y EtBr en fibroblastos dérmicos humanos tras la exposición localizada de los fibroblastos de toxinas bacterianas anthrolysin O. fueron incubadas con calceína AM y homodímero de etidio usando un kit vivo muerto de Life Technologies. 100 pg de la unión a la toxina colesterol anthrolysin O 13 (un regalo del Dr. Richard Rest, Drexel University) fue entregado por micropipeta en el centro de la placa de cultivo, y las imágenes de fluorescencia de campo amplio recogieron utilizando un objetivo de 40x después de 30 min. Imágenes de varios campos fueron combinadas para generar la imagen más grande muestra usando Metamorfo.
Figura 4. Entrada de calcio en el citosol de las células dendríticas humanas expuestas a la SLO toxina bacteriana. Las células se cargaron con fura2 AM antes de la entrega de una solución de SLO a una concentración de 80 U / l y una velocidad de flujo de 1 nl / min. La punta de la micropipeta utilizada para la entrega se indica en el tiempo 0 por un asterisco amarillo. Las imágenes se recogieron continuamente en el modo de campo amplio en 340 y 380 nm longitud de onda de excitación, y la relación de las emisiones utilizadas para determinar los niveles de calcio citosólico. Turno de verde a azul pseudocolor indica un aumento en los niveles de calcio citosólico. La marca de tiempo en cada panel indica los segundos después de comenzar la adición de toxina. Barra de escala es de 20 micras. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Lanzamiento de microvesículas de la superficie de las células dendríticas expuestos a SLO. Las células se pre-incubaron con anti-CD11c conjugado con APC para etiquetar la membrana de plasma, seguido de la entrega de un bolo de U 3x10 -3 de SLO. Reconstrucciones 3-D fueron generados a partir confocal z-pilas recogidas en cada punto de tiempo se indica en minutos. La punta de la microinyector se identificó utilizando formación de imágenes DIC y se indica por la flecha amarilla. Barra de escala es de 20 m.
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Discussion
Las técnicas aquí descritas permiten el examen de las respuestas de las células inmunes a las toxinas bacterianas. El paso más crítico es el manejo y la dosificación de la toxina. Actividad de la toxina puede ser muy variables, incluso entre diferentes alícuotas de la misma preparación, debido a su fragilidad. Esto requiere ya sea probando cada parte alícuota de toxina contra una línea celular de referencia o glóbulos rojos o el uso de gradientes de toxina. Gradientes de toxina, como entregado por micropipeta, permitir que el espectro completo de actividades inducidas por toxinas que han de observarse en tiempo real, pero no se presta al análisis bioquímico.
Micropipetas entrega de la toxina puede ser un reto. A diferencia de microinyección estándar, sin embargo, la penetración de la celda no es necesario para este ensayo. De hecho, se debe tener cuidado de no dañar las células con la misma aguja, ya que esto provocará una respuesta membrana reparación similar 12. En las células inmunes, en particular, los flujos de calcio generado poraguja contacto se propagan a través de los nanotubos a otras celdas dentro de la cultura 11. Células no inyectables también extender la vida útil de la aguja. Asimismo, el uso de una lente de Bertrand seguir descenso de la aguja a las células elimina cierta incertidumbre en el posicionamiento de la micropipeta. Aunque las agujas dañadas se escapará toxina más rápidamente que las agujas intactas, todavía se puede utilizar para generar resultados preliminares. El sistema microinyector permite múltiples inyecciones, un gradiente de toxina debe ser superior deseado. Alternativamente, duración de la inyección también se puede modificar para alterar la dosis suministrada. El microinyector también permite múltiples experimentos que se realizarán en un plato. Además, el efecto de la reexposición puede ser estudiado. Aunque se describen experimentos que examinaban las células inmunes, estos métodos podrían ser adaptados a otras líneas celulares también.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Richard Rest por el generoso regalo de anthrolysin O, Michael Caparon por el don generoso de los francos SLO plásmido y Jonathon de asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones T32CA82084 (PAK), y R01AI072083 (RDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
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References
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