Summary

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Published: October 27, 2012
doi:

Summary

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Abstract

Gelenkknorpel leidet unter einer begrenzten Kapazität, wenn Reparatur durch mechanische Insult oder abgebaute durch Krankheiten, wie Osteoarthritis beschädigt. Um diesem Mangel abzuhelfen, haben mehrere medizinische Eingriffe entwickelt. Eine solche Methode ist, um den beschädigten Bereich mit Tissue-Engineering Knorpel wieder auftauchen, aber die gezüchteten Gewebe in der Regel fehlen die biochemischen Eigenschaften und Haltbarkeit von nativen Knorpel Frage der langfristigen Überlebensfähigkeit. Dies beschränkt die Anwendung von Knorpelgewebe Engineering zur Reparatur von kleinen fokalen Fehlern, die sich auf das umgebende Gewebe, um die implantierte Material zu schützen. Um die Eigenschaften des entwickelten Gewebe zu verbessern, ist eine mechanische Stimulation eine beliebte Methode verwendet, um die Synthese von Knorpel extrazellulären Matrix sowie die resultierenden mechanischen Eigenschaften des gezüchteten Gewebe zu verbessern. Mechanische Stimulation gilt Kräfte auf das Gewebe konstruiert analog zu den erfahrensten in vivo. Diesbasiert auf der Prämisse, dass die mechanischen Umgebung, teilweise, reguliert die Entwicklung und Wartung von nativem Gewebe 1,2 basiert. Die am häufigsten angewandte Form der mechanischen Stimulation im Knorpel Tissue engineering ist Dynamikkompression bei physiologischem Stämme von etwa 5-20% bei einer Frequenz von 1 Hz 1,3. Mehrere Studien haben die Auswirkungen der dynamischen Kompression untersucht und haben gezeigt, dass es einen positiven Effekt auf Chondrozytenmetabolismus und Biosynthese haben, letztendlich auch die funktionellen Eigenschaften des entwickelten Gewebe 4-8. In diesem Papier zeigen wir die Methode zur mechanischen Stimulierung Chondrozyten-Agarose Hydrogel Konstrukten unter dynamischer Kompression und Analyse der Veränderungen in der Biosynthese durch biochemische und radioaktiven Assays. Dieses Verfahren kann auch ohne weiteres modifiziert werden, um alle möglicherweise induzierte Veränderungen in zelluläre Reaktion als Folge der mechanischen Reizen zu beurteilen.

Protocol

Ein. Isolation of Primary Chondrozyten Ernte 10-15 volle Dicke Knorpel Scheiben von den Gelenkflächen des tierischen Gelenken (zB das Mittelhandknochen-Phalangealgelenk von ausgewachsenem Skelett Kühen von einem lokalen Schlachthof gewonnen). Ort Knorpel Scheiben in einer 100 mm Petrischale und Inkubieren in 20 ml 0,5% Protease in Ham-F-12 (w / v) für 2 Stunden bei 37 ° C. Spülen Sie drei Mal in Ham-F-12 Kulturmedien und inkubieren mit 20 ml 0,15% Collagenase A in Ha…

Discussion

Das beschriebene Verfahren für das Auftragen kontrollierter mechanische Reize auf Zellen seeded Agarose Hydrogele ermöglicht die direkte Untersuchung der Auswirkungen von dynamischen Druckkräfte auf Chondrozytenmetabolismus. Die Verwendung des kundenspezifischen Prüfstand in Verbindung mit den Halteringen versehen seitliche Beschränkung für die Konstrukte, um mögliche Probleme der Probe Kippen zu vermeiden. Die Verwendung von dead-gewichtete Belastung Platten durch Mengen Crews gesichert gewährleistet den …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent or equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific SH3001002
Collagenase A Sigma Aldrich Ltd. C0130
Protease Sigma Aldrich Ltd. P5147
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich Ltd. F1051
Ascorbate Sigma Aldrich Ltd. A4034
Antibiotics/antimycotics Sigma Aldrich Ltd. A5955
HEPES Bioshop Canada Ltd. HEP001
Trypan blue Sigma Aldrich Ltd. 93595
Reichert Bright-Line Hemacytometer Hausser Scientific 1490
Quant-iT PicoGreen Invitrogen P7589
Papain from papaya latex Sigma Aldrich Ltd. P3125
Ammonium Acetate Sigma Aldrich Ltd. A1542
Ethyldiaminetetraacetic Acid Sigma Aldrich Ltd. E9884
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich Ltd. 43819
Low Melting Point Agarose, Type VII Sigma Aldrich Ltd. A9045
Mesh Screen (200) Filter Sigma Aldrich Ltd. S4145
Mach-1 Micromechanical Tester Biomomentum Inc. V500cs
Compression Loading Jig Custom-built Similar product could be supplied by Biomomentum Inc.
Falcon 24 Well Culture Plate Thermo Fisher Scientific B353047
β-Liquid Scintillation Counter Beckman Coulter LS6500
[3H] Proline Perkin-Elmer NET323005MC
[35S] Sulfur Perkin-Elmer NEX041005MC

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Cite This Article
Kaupp, J. A., Weber, J. F., Waldman, S. D. Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels. J. Vis. Exp. (68), e4229, doi:10.3791/4229 (2012).

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