Summary

Механическая стимуляция хондроцитов-агарозы Гидрогели

Published: October 27, 2012
doi:

Summary

Биосинтез внеклеточного матрикса хрящевой хондроцитами могут быть затронуты применением механических раздражителей. Этот метод описывает технику применения динамической деформации сжатия в хондроциты заключены в 3D конструкций и оценки изменений, вызванных в метаболизм хондроцитов.

Abstract

Суставной хрящ страдает от ограниченной возможности ремонта при повреждении механических оскорбление или деградировали от болезней, таких как остеоартрит. Чтобы исправить этот недостаток, несколько медицинских вмешательств были разработаны. Одним из таких методов является выплывут поврежденную область с тканевой инженерии хряща, однако, инженерные ткани обычно не хватает биохимические свойства и долговечность родной хряща, ставят под сомнение его долгосрочной жизнеспособности. Это ограничивает применение хряща тканевой инженерии для ремонта небольших дефектов координационные, опираясь на окружающие ткани для защиты имплантированных материалов. Для улучшения свойств разработанных тканей, механическое раздражение это популярный метод используется для повышения синтеза хрящевой внеклеточного матрикса, а также результирующий механических свойств инженерии тканей. Механическое раздражение распространяется силы на ткани строит аналогичные тем, которые имели в естественных условиях. Этооснован на предпосылке, что механические окружающей среды, в частности, регулирует развитие и поддержание родной 1,2 ткань. Наиболее часто применяются формы механического раздражения в тканевой инженерии хряща динамического сжатия при физиологических штаммов примерно 5-20% на частоте 1 Гц 1,3. Несколько исследований изучали эффекты динамического сжатия и показали, что это оказывает положительное влияние на метаболизм хондроцитов и биосинтеза, в конечном счете, влияет на функциональные свойства разработанных тканей 4-8. В этой статье мы проиллюстрируем метод механической стимуляции хондроцитов-агарозы конструкций гидрогеля при динамическом сжатии и анализировать изменения в биосинтезе путем биохимического и радиоизотопного анализа. Этот метод также может быть легко модифицирован для оценки любых потенциально индуцированные изменения в клеточной реакции в результате механических раздражителей.

Protocol

1. Изоляция первичной суставные хондроциты Урожай 10-15 полном кусочки хряща толщиной от суставных поверхностей суставов животных (например, пястных, фаланг стыке скелет взрослых коров получено от местных abbatoir). Место хряща ломтики в 100 мм чашки Петри и инкубиру?…

Discussion

Описанный способ применения управляемых механических раздражителей на мобильный семенами агарозном гидрогелей позволяет прямое расследование эффекты динамического сжимающих сил на метаболизм хондроцитов. Использование пользовательского тестирования установки в сочетании с с…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent or equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific SH3001002
Collagenase A Sigma Aldrich Ltd. C0130
Protease Sigma Aldrich Ltd. P5147
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich Ltd. F1051
Ascorbate Sigma Aldrich Ltd. A4034
Antibiotics/antimycotics Sigma Aldrich Ltd. A5955
HEPES Bioshop Canada Ltd. HEP001
Trypan blue Sigma Aldrich Ltd. 93595
Reichert Bright-Line Hemacytometer Hausser Scientific 1490
Quant-iT PicoGreen Invitrogen P7589
Papain from papaya latex Sigma Aldrich Ltd. P3125
Ammonium Acetate Sigma Aldrich Ltd. A1542
Ethyldiaminetetraacetic Acid Sigma Aldrich Ltd. E9884
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich Ltd. 43819
Low Melting Point Agarose, Type VII Sigma Aldrich Ltd. A9045
Mesh Screen (200) Filter Sigma Aldrich Ltd. S4145
Mach-1 Micromechanical Tester Biomomentum Inc. V500cs
Compression Loading Jig Custom-built Similar product could be supplied by Biomomentum Inc.
Falcon 24 Well Culture Plate Thermo Fisher Scientific B353047
β-Liquid Scintillation Counter Beckman Coulter LS6500
[3H] Proline Perkin-Elmer NET323005MC
[35S] Sulfur Perkin-Elmer NEX041005MC

References

  1. Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
  2. Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
  3. Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
  4. Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
  5. Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
  6. Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
  7. Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
  8. Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
  9. Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
  10. Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
  11. McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
  12. Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
  13. Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
  14. Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
  15. Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
  16. Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
  17. Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).

Play Video

Cite This Article
Kaupp, J. A., Weber, J. F., Waldman, S. D. Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels. J. Vis. Exp. (68), e4229, doi:10.3791/4229 (2012).

View Video