Summary
Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sunmak
Abstract
Sağlıklı bir bağışıklık sistemi kendi antijenlerine tolerans kalırken T hücrelerinin yabancı antijenleri yanıt gerektirir. T hücre reseptör (TCR) α ve β lokusların Rastgele düzenlenmesi öz ve yabancı hem antijen özgüllüğü engin çeşitliliği ile T hücre repertuarı oluşturur. Timusta gelişimi sırasında repertuar seçimi güvenli ve kullanışlı T hücreleri üretmek için önemlidir. Timik seçiminde Kusur otoimmün ve immün bozuklukları 1-4 gelişmesine katkıda bulunur.
T hücre progenitörler CD4 veya CD8 co-reseptörleri ifade etmezler çift negatif (DN) timositleri olarak timus girin. ΑβTCR hem eş-reseptör ekspresyonu çift pozitif (DP) aşamada gerçekleşir. Öz-peptid-MHC (pMHC) timus hücreleri tarafından sunulan ile αβTCR Etkileşimi DP timosit kaderini belirler. Yüksek afinite etkileşimleri olumsuz seçimi ve ortadan kalk yolkendinden reaktif timositlerin tion. CD4 veya kendinden MHC 5 tarafından sunulan yabancı antijenleri tanıma yeteneğine CD8 tek pozitif (SP) T hücrelerinin pozitif seçimi ve gelişimi Düşük afinite etkileşimleri sonucu.
Pozitif Seçimi olgun T hücrelerinin üretimi gözlemleyerek bir poliklonal (yabani-tip) TCR repertuarı ile farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerir negatif seçim çalışma için ideal değildir. Birçok model sistemler negatif seçim çalışma ama fizyolojik olaylar 6 özetlemek için yeteneklerini değiştirmek için kullanılan edilmiştir. Eksojen antijen uygulamasından timositlerde 7-9 non-spesifik silme yol açabilir Örneğin, timositlerde in vitro uyarımı olarak, iç içe işlemine dahil olan timik ortam yoksundur. Şu anda, in vivo negatif seleksiyon eğitim için en iyi araçları bir transgresyon ifade fareler vardırself-antijen endojen için ENIC TCR özgü. Bununla birlikte, birçok klasik TCR transjenik modelleri prematüre negatif seçim ile sonuçlanan, DN aşamada transgenik TCRα zincirinin erken ifade ile karakterize edilir. Bizim laboratuvar olarak 10 yabani-tip farelerden oluşan negatif seleksiyon SP geçiş DP sırasında meydana sağlayan, transgenik HY TCRα şartlı DP aşamada ifade edildiği HY cd4 model geliştirdi.
Burada, HY cd4 fare modelinde timik pozitif ve negatif seçim incelemek için bir akış sitometri tabanlı protokol açıklar. HY CD4 farelerde, negatif seleksiyon çok fizyolojik olmakla birlikte, bu yöntemlerin diğer TCR transjenik modelleri ile de uygulanabilir. Biz de herhangi bir genetik manipüle fare için geçerli bir poliklonal repertuar olumlu seçimi analiz için genel stratejiler sunacak.
Protocol
Deneysel protokol genel bir şema için Şekil 1 'e bakınız.
1. Teşrih
- 60 x 15 mm Petri kabı içine yerleştirin steril çelik örgü ekran. Bir birim doku örneği başına gereklidir.
- Her bir tabak için Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 5 ml ilave edilir. Buz üzerinde yemekleri tutun.
- CO 2 ile farelerin Euthanize.
- Diseksiyon yüzey Güvenli fare yukarı bakacak ventral tarafta. Sterilizasyon için% 70 etanol ve kürk aşağı keçeleşmiş sağlamak için Sprey fare.
- Cerrahi makas kullanarak, sadece genital Yukarıdaki karın derisinde bir ventral kesi yaparak diseksiyon başlar. Çene insizyon yukarı uzatın.
- Midline itibaren, tüm uzuvları boyunca kesi uzanması. Gevşek cilt geri çekin ve diseksiyon yüzeye aşağı pin.
- Timus Harvest:
- Bir kesi yapmak için sternumun alt ucu kaldırın.
- Karaciğer kaçınmak, göğüs kafesi ayırmak ve sonra her tarafa göğüs kafesi kesmek için diyafram kesti. Akciğer ve kalp önlemek için dikkat çekici, her iki tarafta göğüs kafesi yukarı kesin.
- Göğüs kafesi arkasında forseps ile yavaşça çekin. Timus kalp üzerinde bulunan bir beyaz, bilobe organdır. Lobların alt kavramak için forseps düz kenar kullanarak yavaşça timus çekin ve ekran örgü üzerine yerleştirin.
- Dalak Harvest:
- Dalak karaciğer aşağıda farenin karın boşluğunda, sol tarafında yer alan kırmızı, sörf tahtası şeklinde bir organdır.
- Karın boşluğuna bir kesi olun. Yavaşça bağ dokusu uzakta tease ikinci çifti kullanılarak, forseps bir çift ile dalak dışarı çekin. Ayrı bir boy gözenekli elek üzerinde dalak yerleştirin.
2. Hücre Hazırlanması
- 3 ml şırınga bir pistonu kullanarak, eziyetsadece bağ dokusu ve yağ kalıntıları kadar ekran örgü içine organları. Çanak HBSS üç kez örgü durulayın. Her doku örneği için yeni bir dalgıç kullanın.
- Doku homojenleştirici için diğer seçenekler bu yöntem yerine kullanılabilir.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 335 santrifüje edilerek pellet hücreler 4 ° C 'de 5 dakika xg
- Oda sıcaklığında 10 dakika için ACK lizis tamponu 500 ul (0.15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0.1 mM Na 2 EDTA, pH 7.2) içinde süspanse splenositlerin. 20 süspanse timositleri x 10 6 hücre / ml FACS tampon (PBS,% 1 FCS,% 0.02 sodyum azid) ve buz üzerinde bir kenara koyun.
- HBSS 5 ml ekleyerek izotoniklik için splenositlerin dönün. Pelet 20 santrifüj ve tekrar süspansiyon tarafından splenositlerin x 10 6 hücre / FACS tampon ml. Hücrelerinin steril kalması gerekiyorsa, steril RPMI +% 10 FCS kullanabilirsiniz.
3.Akış sitometrisi için Boyama Hücreleri
Bu protokolün amacı, yabani-tip (WT) ve HY cd4 fareler kullanarak pozitif ve negatif seçim analizi için stratejilerin altını çizmektir. Flow sitometri deneysel tasarım, satın alma, ve analizi ile ilgili genel değerlendirmeler için, biz Tung ark mükemmel bir inceleme okuyucuları bakın. 11.
- Alikot 4 x 10 96-kuyulu plakanın her bir kuyucuğa akış sitometrisi numune başına 6 timositlerde yanı sıra, telafi kontrol başına 1 x 10 6 WT splenositlerin. Transgenik fareler kullanarak, size deneyde bir denetim olarak WT fare içermelidir.
- Buz üzerinde 10 dakika için anti-CD16/32 (klon 2.4G2) ile hücreler inkübe ederek Fc reseptörleri bloke ederler.
- 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 335 x g'de plaka Spin. Kapağını kaldırın ve bir kez plaka iterek kuyulardan sıvı dağıtmak, bir lavabo içine doğru bakmalıdır. FACS tamponu içinde 200 ul her bir kuyu yeniden süspanse edin. Yıkama tekrarlayın.
- Aşağıda listelenen de FACS tampon başına 200 ul içinde seyreltme göre her bir antikor için optimum konsantrasyonu kullanılarak, antikor kokteyller hazırlayın. Her bir antikorun en uygun konsantrasyon pozitif ve negatif nüfusun büyük ayırma vermek için gereken en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır. , Belirli bir antikor için negatif bir nüfus var ise, bir antikor izotip dahil edilmelidir. İstenirse kuyu başına toplam hacmi (kuyu başına 100 ul) örneğin küçültülmüş olabilir.
- WT timüs: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24
- Timus HY CD4: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24
CD69 lo ve timositleri yılında CD69 yüksek nüfus daha iyi ayrılması elde etmek için, onun tarafından izlenen bir biotinlenmiş anti-CD69 primer antikor kullanılması tavsiye edilir ikincil bir florokrom-konjuge streptavidin içeren leke. Biz uCD5 boyama için se aynı stratejiyi.
- Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde antikor kokteyli 200 ul hücre ile inkübe edin.
- Antikor kokteyli boyama ile eş zamanlı olarak, tek bir florokrom-konjuge antikor ile her kompanzasyon kontrolü leke. İdeal olarak, dengeleme boyama antikor kokteyli içinde kullanılan aynı antikorları içerir. Birçok antijen test ediliyor Ancak, her bir antijen için boyama büyük deneyler için uygun olmayabilir. Bu nedenle, anti-CD4, anti-CD8 ya da ya da için yüksek renklendirme, bu antijenlerin ifadesi ya da telafi boncuk kullanımına bağlı olarak tavsiye edilir. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde Leke. Bir telafi kontrolü boyanmadan bırakın.
- FACS tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın.
- FACS tampon ve FACS tüplerine transfer süspanse edin hücreleri.
- Akış sitometresinde örnekleri edinin. FSC-A edinimi ve FSC-W dahilçiftli ayrımcılık llow.
4. Akım Sitometri Veri Analizi - Sigara TCR Transgenik Fare
Biz flow sitometri veri analizi için FlowJo kullanın. Non-TCR transgenik fareler için yolluk strateji 2A Şekil bakın.
- SSC, "lenfosit" nüfus üzerindeki elektronik kapıdan FSC-A kullanma.
- "Lenfosit" nüfus içinde, hücre çiftler ve aggregrates dışlamak için elektronik kapı FSC-W lo nüfus FSC-W tarafından FSC-A kullanın. Bu "singlet" kapısıdır.
- "Singlet" kapısı, CD4 arsa CD8 olayları kullanma. DN, DP donuk, DP aydınlık için geçitler çizin, CD4 Şekil 2B'de gösterildiği gibi + CD8 lo, CD4SP ve CD8SP nüfus.
- CD4SP ve CD8SP kapılar altında, CD24 araziler tarafından TCRβ oluşturun. Şekil 2C tasvir gibi kapıları çizmek için kadranda gating aracını kullanın.
- A ne oluşturmaCD69 ile TCRβ: "tekli" kapısı w arsa. Kapıları A, B, C, D, Şekil 2B'de gösterilmiştir. Çizme
- CD5 tarafından TCRβ: "tekli" kapıdan başka bir arsa oluşturun. Şekil 2E tasvir gibi kapıları i, ii, iii, iv çizin. Bu pozitif seleksiyon incelenmesi için başka bir stratejidir.
- Kapıları i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Şekil 2B, E) "singlet" altından DN, DP donuk, DP parlak, CD4 int, CD4SP ve CD8SP kapıları uygulayın.
- Eğer hedef nüfus ulaşana kadar sonraki her kapının frekansını organ selülarite çarparak belirli bir alt kümesi hücrelerin sayısını hesaplayın. Örneğin, TCRβ hi CD69-CD8SP timositlerin sayı timüs sellüler x% TCR BHI tarafından belirlenecektir CD69-(D fraksiyonu) x% CD8SP.
- Sayma zaten canlı ve ölü hücreleri böylece "lymphoc içermez dikkate alırhesaplamalarda YTE "kapısı.
5. Akım Sitometri Veri Analizi - TCR Transgenik Fareler
TCR transgenik fareler için yolluk strateji 3A Şekil bakın.
- Adımlarda, önceki bölümlerde olduğu gibi 4.1 ve 4.2 izleyin.
- "Singlet" kapı altında T3.70 üzerine SSC arsa ve kapı bir T3.70 oluşturmak + hücre popülasyonu antijen-spesifik T hücreleri (Şekil 3B) analiz etmek. Bazı durumlarda, bu non-spesifik antijen (T3.70-) T hücre popülasyonu bu nüfusu karşılaştırmak için ilgi çekici olabilir.
- Içinde T3.70 + nüfus, beraberlik DN, DP, CD4SP ve CD8SP kapıları (Şekil 3C).
- Çok az T3.70 + hücreleri olacak gibi WT kontrol örnekleri için, "tekli" kapısının altına bu kapılardan çizmek veya bir T3.70 kapısı oluşturun.
- CD8SP kapısı altında, oluşturmakCD24 arsa T3.70. Dört nüfus (Şekil 3F) içine hücre bölmek için kadranda gating aracını kullanın.
- WT fareler ve HY cd4 farelerin T3.70 + DP bölmesi (Şekil 4A) DP bölmesinde CD69 ekspresyonu gösteren Kalıplı bir histogram oluşturun. CD5 ekspresyonu (Şekil 4B) incelemek için tekrarlayın.
- 4.8 gibi ilgi her alt hücrelerin mutlak sayısını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fizyolojik TCR transgenik modeller ve WT farelerde, pozitif seleksiyon antijen karşılaşma sonrasında DP donuk aşamaya geçmeden önce DP parlak aşamada başlar. DP donuk timositleri ardından CD4SP veya CD8SP timositleri (Şekil 2B) olmadan önce bir geçiş CD4 + CD8 lo sahne girin. Olgun SP timositleri yüksek TCR ekspresyonu ve CD24 (Şekil 2C) kaybı ile karakterize edilir. Profil CD69 veya CD5 tarafından TCRβ inceleyerek, pozitif seleksiyon kusurları ortaya çıkarabilir CD4 CD8 kusur burada yatmaktadır içine daha fazla fikir sağlayabilir iken. CD69 ve CD5 Hem bu belirteçlerin artmış ekspresyonu sürüş güçlü etkileşimler ile, TCR stimülasyonu sonrası sayıları artan edilmektedir.
CD69 arsa TCRβ üzerinde, kapısı A (TCRβ lo CD69-) ön seçim DP timositleri nüfusu temsil kapısı B (TCRβ int CD69 +) bir tr temsildoğrudan TCR nişan, kapısı C (TCRβ hi CD69 +) sonra ansitional nüfusun doğrudan sonrası pozitif seleksiyon hücre nüfusu temsil eder ve D Kapısı (TCRβ hi CD69 -) hücreleri (Şekil 2B) daha olgun bir nüfus oluşturmaktadır. Kapısı B öncelikle bazı DP donuk ve CD4 DP parlak + CD8 lo hücrelerden oluşur ise bir WT fare, kapısı A, DP parlak hücrelerden oluşur. D Kapısı öncelikle CD4SP ve CD8SP oluşur ise Kapısı C öncelikle DP donuk, CD4 + CD8 lo CD4SP hücrelerden oluşur. Popülasyonlarının B ve C yokluğu bozulmuş pozitif seleksiyon göstergesi olabilir. Nüfusun D içerisinde CD8SP için CD4SP oranı değişiklikler soy bağlılığı değişiklikler önerebilir. Nüfus C ve D kaybı pozitif seleksiyon sonrasında sağkalım sorunları yansıtıyor olabilir.
CD5 tarafından TCRβ incelenmesi başka bir strateji töncesi ve sonrası pozitif seçimi popülasyonları tanımlamak o. Nüfus i (TCRβ lo CD5 lo) ön seçim DP timositleri temsil ve nüfus ii (TCRβ lo CD5 int) pozitif seleksiyon (Şekil 2E) başlatan hücrelerdir. Bu nüfus öncelikle DPbright timositleri oluşmaktadır. Nüfus III (TCRβ int CD5 hi) pozitif seçim geçiren sürecinde timositlerde temsil eder ve öncelikle DP mat ve CD4 + CD8 lo timositlerde oluşur. Nüfus iv (TCRβ hi CD5 hi) post-pozitif seleksiyon SP timositlerin öncelikle oluşur. Nüfus ii ve iii Engelli nesil kusurlu pozitif seleksiyon göstermektedir. Normal önceki nüfus rağmen nüfus iv içinde CD8SP için CD4SP oranındaki değişiklikler soy bağlılığı değişiklikler önerebilir. Nüfusun iv bir aradan sonra pozitif SELEC azalmış sağkalım gösterebilirtion. Örneğin, TOX in - / - pozitif seçimi 12 bozulmadan fareler, arızalı CD4SP farklılaşma nüfus iv, C ve D ciddi bir azalmaya yol açar. Pozitif seçim için de geçerlidir kusurları popülasyonları, B, C ve D 13,14 kaybına yol açar DP aşama sırasında Bcl11b inaktivasyonu ile görülebilir. RasGRP1-eksik farelerde yalnızca nüfusun varlığı sonucu, pozitif seçimi önceki bir kusur varsa A (yayınlanmamış veri).
Negatif seçim küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerdiğinden, bu işlemde kusurların en TCR transjenik fareler kullanılarak izlenir. HY CD4 farelerde, transgenik HY TCR ifade timositlerde monoklonal antikor T3.70 (Şekil 3B) ile tespit edilebilir. HY TCR MHC sınıf kimliği b içinde sunulan erkek özgü HY antijeni tanır. Böylece, HY cd4 erkek (M) fareler HY TCR negatif seçilime maruz
TCR transgenik modellerin Bir ihtar transgenik TCR timosit gelişim boyunca oldukça ifade olmasıdır. Sonuç olarak, bu daha fazla TCR ve CD69/CD5 ifade temel popülasyonlarının tanımlanması ile pozitif seçim karakterize etmek zordur. Ancak, CD69 ve CD5 ifade TCR sinyal gücü ile korelasyon yoktur. WT farelerde, çoğu DP timositleri pMHC arasında TCR nişan gerektiren pozitif veya negatif seçim, uğramayan, ve böylece CD69 veya CD5 upregulate yok. HY cd4 F fareler gibi WT (Şekil 4A) karşılaştırıldığında CD69 + nüfus bir artış gösterdiği pozitif seleksiyon, geçmesi T3.70 + DP timositleri büyük bir nüfusa sahip. Negatif seçim pozitif seleksiyon daha yüksek bir afinite TCR uyarıcı içerir; Bu HY cd4 M farelerde T3.70 + DP timositleri üzerindeki CD69 yüksek ifadesi ile gösterilir, bir vardiya o sonuçlanansağa f histogramı tepe. Benzer eğilimler CD5 ekspresyonu (Şekil 4B) ile birlikte görülür. , Genetik olarak manipüle farelerde timus seçimi analiz CD69 inceleyerek veya CD5 ifade defekt TCR sinyal veya TCR stimülasyon bir alt sonuçla yatıyor belirlemek zaman.
Şekil 1. Deneysel protokol genel şeması.
Şekil 2. Olmayan TCR transgenik farelerde timus seçim analizi. Non-TCR transgenik farelerde timus seçimi analiz için (A) Yolluk stratejisi. (B) bir WT timüs CD4 profil ile CD8. (C) TCRβ ve CD24 ekspresyonu ile SP timositlerin vade incelenmesi. (D) pozitif seçim aşamaları ile ayırt edilebilirTCRβ ifade ile CD69, CD8 ve her alt profilleme CD4 birlikte. (E) CD5 tarafından TCRβ gelişim evreleri ayırmak için kullanılabilecek başka bir stratejidir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. HY cd4 farelerde timus seçim analizi. TCR transgenic farelerde timik seçim analiz için (A) 'Ayırıcı strateji. (B) WT HY TCR (T3.70 +), HY cd4 F ve HY cd4 M farelerin ifade timositlerin sıklığı. (C) belirtilen farelerde T3.70 + nüfusun CD4 profilleri ile CD8. Frekanslara ek olarak, T3.70 + DP (D) ve özellikle T3.70 + CD8SP (E) timositlerin mutlak sayı negatif seleksiyon önemli göstergelerdir. (F) incelenmesiBelirtilen farelerde CD8SP timositleri vade. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Aktivasyon göstergeleri (B) toplam WT ve T3.70 gelen DP timositleri HY cd4 F ve HY cd4 M farelerden alınan + DP timositleri üzerindeki CD69 (A) ve CD5 Ekspresyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol olmayan TCR transjenik ve TCR transgenic farelerde pozitif ve negatif seçim incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, yüzey antijenlerinin boyama açıklanmaktadır. Moleküler mekanizmalarının daha fazla analiz için, genellikle hücre içi boyama yapmak için gereklidir. Biz transkripsiyon faktörleri için en intraselüler proteinler ve BD Biosciences Foxp3 Boyama Seti BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kiti kullanın. Biz genellikle hemen boyama sonra örnekleri kazanır. Bununla birlikte, örnekler 4 az% 1 formaldehit ° C de karanlık ile FACS tamponu içerisinde gece boyunca saklanabilir. Bazı florokromlar ve antikorlar fiksasyon ile uyumlu olmayabilir unutmayın.
Pozitif seçimi analizi için, biz, negatif orta ve yüksek ifade popülasyonları daha iyi ayrılması (Şekil 2) sağlamak için biotinlenmiş anti-CD69 ve anti-CD5 kullanmanızı öneririz. Sonuç olarak, Örnek de açıklandığı gibi,Bu yolluk stratejinin iki farklı takip gerektirebilir olarak, soy bağlılığı olumlu seçiminde kusurları ayırt etmenize yardımcı olacak. Olgun SP timositlerin kuşak ek olarak, pozitif seçim IL-7Rα ve CCR7 upregülasyonunu ile teyit edilebilir. Ancak, bu belirteçler SP timositleri 15,16 oranla sonrası seçimi DP timositleri düşük düzeyde ifade edilmiştir. DP bölmesi içinde olgunlaşma aşamaları ayrıntılı bir analiz için, intraselüler Zap70 ifadesi 17 ölçülebilir. Bu tür i ve TCRβ x CD5 arsa (Şekil 2E) üzerinde ii olarak olgunlaşma belirteçlerinin, benzer bir ifade ile bu nüfus göstermede özellikle yararlı olabilir, farklı gelişim aşamalarında temsil eder.
HY CD4 modeli transgenik TCR pozitif ve negatif seçim yanı sıra, fizyolojik ifade hem de temsil avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, bu yöntemler uygulanabilirbazı hususlar ile diğer TCR transgenik modeller. Sürekli, antijene özel T hücrelerinin çalışma sağlamak için tercih edilen bir transgenik TCR karşı bir antikor içerir. Bazı analizler için bir iç kontrolü gibi spesifik olmayan nüfus antijen spesifik nüfus karşılaştırmak için ilgi çekici olabilir. Diğer TCR transgenik modeller negatif seleksiyon incelenmesi daha özen gerektiriyor. Negatif seleksiyon yer aldığı esnada timosit gelişim aşamasında farklı TCR transgenik modeller arasında değişir. HY CD4 timositlerde negatif seçim 10,18 (Şekil 3) için doğru okuma, bu nedenle HY-özgü CD8SP döl nüfusun analiz DP aşamada pMHC girerler. Negatif seçim klasik HY fareler 19 olarak DP için geçiş DN sırasında ortaya çıkarsa, ilgi analiz antijen-spesifik DP timositleri varlığı ya da yokluğu olacaktır. Yerde HY antijene karşı Seçimi timik oluşurkorteks 20. Buna karşılık, doku kısıtlı antijenlere karşı negatif seçim timik medulla 21,22 meydana gelir. Ova antijen tek timik medulla ve pankreas 23 aktif olan insülin sıçan promotör kontrolü altında ifade edilir gibi OT-I RIP-mova fareler Bu tür bir seçim tekrarlamak. Timik kortekste DP timositlerin pozitif seleksiyon ilk medulla, OT-I TCR + CD8SP timositleri OT-I Rip-mova farelerde 24 başarılı negatif seçimi gösterir olgun yokluğunda (CD24 lo) göç için gerekli olduğundan.
TCR transgenik fareler kullanarak antijene spesifik hücre büyük bir nüfus incelemek mümkün olma avantajına sahip olsa da, potansiyel bir ihtar transgenik TCR pozitif ve negatif seçim aracılık yapabilir sınırlı ligandlar nedeniyle T hücre gelişimi değişir. RAG-yeterli HY cd4 farelerde, başka bir ihtar endoge o co-ifadesidirnous TCRα zincirleri HY TCR + timositleri bir azınlık üzerinde pozitif ve negatif seçim modüle potansiyeline sahiptir. Bu ihtar genel HY cd4 modeline özgü değildir, daha ziyade TCR transgenik modeller. Sunulan temsilcisi HY cd4 bir Rag-yeterli arka plan üzerine HY cd4 farelerin türetilmiştir. Doğada biraz daha karmaşık olsa da, sınırlı habercisi frekans daha fizyolojik ortamda timosit seçimi okumak için birçok yol vardır. Örneğin, TCR transjenik ve WT karışık kemik iliği kimeralar antijen-spesifik haberci timosit sıklığını azaltmak için oluşturulabilir. Ayrıca, böyle bir HY TCR 25 Vb8 zincir ya da haberci frekans sınırlamak için OT-I TCR 26 VB5 zinciri olarak, sadece bir transgenik TCRβ zincir ifade fareler kullanabilir. Transgenik TCRβ zinciri antijen spesifik timositleri yeniden izleme çeşitli endojen TCRα zincirleri ile eşleştirilmiş olduğundanpMHC tetramerleri kullanımı yapılmasını gerektirir. Bu yöntemin bir sınırlaması TCR ifade tetramers ile algılama sağlamak için DP timositleri üzerinde çok düşük olmasıdır. Bu pozitif ve negatif seçim yol DP timositleri içinde moleküler mekanizmaların daha fazla çalışma sınırlar. Daha yakın zamanlarda, pMHC tetramerleri ve manyetik boncuk zenginleştirme bir kombinasyonu 27 ayarlanmamış farelerde CD4 küçük, antijen-spesifik T hücrelerinin popülasyonları + numaralandırmak için kullanılmıştır.
Negatif seçimi öncelikle içsel apoptoz yolu ile kendinden reaktif timositlerin klonal delesyon aracılık etmektedir. Apoptotik timositleri yarılan kaspaz-3 hücre içi boyama kullanılarak akış sitometri ile tespit edilebilir. BH3-sadece Bcl-2 ailesi üyesi Bim TCR stimülasyon 18,28 yanıt timositleri kaspaz-3 aktivasyonu için gereklidir. Farklı TCR transgenik modeller için Bim-eksik farelerde kapısı olarak, bizim laboratuvar Bim negatif SELEC için gerekli olduğunu tespit etmiştirBirden çok negatif seleksiyon mekanizmaları 18,29 varlığını gösteren her yerde kendi antijenlerine ama doku-kısıtlı antijenlere karşı tion. Benzer yaklaşımlar timik negatif seleksiyon 30,31 bir başka kilit arabulucu olarak yetim steroid reseptör Nur77 koymaktadır. HY cd4 farelerin DP timositleri transkripsiyonel analizi özellikle pozitif ve negatif seçim 32 sırasında uyarılan genlerin bir listesini oluşturdu. Bu genlerin manipüle fareler burada sunulan yöntemlerin uygulanması timik seçim moleküler mekanizmaları içgörü sağlayabilir.
Bu periferik immün bölmesinin bir analizi ile timik seçimi incelenmesi takip için idealdir. Ancak, merkezi ve periferik silme ayırmak zordur. Negatif seçim sonuçta otoimmünite yokluğu ile yansıtılır. Onlar sınırlamaları olmasına rağmen, TCR transgenik fareler için güçlü ve pratik bir yoldurfizyolojik negatif seleksiyon çalışması. Özellikle gen eksik farelere Geçişi TCR transgenik farelerin negatif seleksiyon moleküler mekanizmalarının araştırılması için etkili bir yoldur. Bu farkında olmak önemlidir, ancak, bir gen kusuru nedeniyle periferik inflamasyon kortikosteroidler ve sitokinler 7-9 aracılık non-spesifik timosit silinmesine yol açabilir. Bu gibi durumlarda, burada sunulan strateji iltihap başlangıcından önce neonatal fareden thymi analizi ile uygulanabilir. Pozitif seçim, diğer taraftan, araştırmacılar melezleme ve sıkıntılar tasarruf ya TCR-veya non-TCR transjenik modellerinde çalışıldığı edilebilir. Pozitif ve negatif seçim dahil moleküllerin daha iyi anlaşılması otoimmün ve immün hastalıkların tanı ve tedavisinde yeni stratejilerin gelişmesine neden olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar kendi teknik yardım için Bing Zhang teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (MOP-86595) için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. SEKME CIHR Yeni Araştırmacı ve AHFMR Scholar olduğunu. Doktora ve AIHS Tam zamanlı Bursu - HY bir CIHR Kanada Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. SAN Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. Doktora - AYWS bir NSERC Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
