Summary
우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을 제시
Abstract
건강한 면역 체계가 자기 항원에 허용 남아있는 동안 T 세포가 외국 항원에 반응해야합니다. T 세포 수용체 (TCR) α와 β loci의 무작위 다시 정리하기는 자신과 외국에 모두 항원 특이성의 광대 한 다양성과 T 세포 레퍼토리를 생성합니다. thymus에서 개발 중에 레퍼토리의 선택은 안전하고 유용한 T 세포를 생성 중요합니다. thymic 선택에 결함이 면역과 면역 결핍 장애 1-4의 발전에 기여하고 있습니다.
T 세포 progenitors은 CD4 또는 CD8 공동 수용체를 표현하지 않는 2 중 부정 (DN) thymocytes로 thymus를 입력합니다. αβTCR하고 두 공동 수용체의 표현은 '더블 긍정적 (DP) 단계에서 발생합니다. 자기 펩타이드-MHC (pMHC) thymic 세포에서 제공과 αβTCR의 상호 작용은 DP의 thymocyte의 운명을 결정합니다. 높은 연관성 상호 작용은 부정적인 선택과 elimina로 연결자기 반응성 thymocytes의 기. CD4 또는 자기 MHC (5)에 의해 제시 외국 항원을 인식 할 수 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) T 세포의 긍정적 인 선택과 개발에 낮은 친화 상호 작용 결과.
긍정적 인 선택은 성숙 T 세포의 생성을 관찰하여 polyclonal (wildtype) TCR의 레퍼토리와 마우스에서 공부 할 수 있습니다. 그러나, 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함 부정적인 선택의 연구에 적합하지 않습니다. 대부분의 모델 시스템은 부정적인 선택을 공부하지만, 생리 이벤트에게 6 요점을 되풀이하는 능력에 따라 다를하는 데 사용되었습니다. 외인성 항원의 행정 thymocytes 7-9의 비 특정 삭제 될 수 있습니다 예를 들어, thymocytes의 체외 자극에 깊은 선택에 관여 thymic 환경을 부족합니다. 현재 생체 부정적인 선택에서 공부에 가장 적합한 도구 transg을 표현할 마우스 아르자기 항원 내생에 enic TCR의 특정. 그러나 많은 고전 TCR 유전자 변형 모델은 조기 부정적인 선택의 결과로, DN 단계에서 유전자 변형 TCRα 체인의 조기 표현을 특징으로하고 있습니다. 우리 연구소는 10 wildtype 마우스에서 발생하는 부정적인 선택 SP 전환에 DP 동안 발생 할 수 있습니다 유전자 변형 HY TCRα이 조건 DP 단계에서 표현되는 HY의 CD4 모델을 개발했습니다.
여기, 우리는 HY의 CD4 마우스 모델에서 thymic 긍정적이고 부정적인 선택을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반의 프로토콜을 설명합니다. HY의 CD4 마우스의 부정적인 선택이 매우 생리이지만,이 방법은 다른 TCR 유전자 변형 모델에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 또한 유전자 조작 마우스에 적용 polyclonal 레퍼토리에 긍정적 인 선택을 분석하는 일반적인 전략을 제시합니다.
Protocol
실험 프로토콜의 전반적인 구조에 대해 1 그림을 참조하십시오.
1. 해부
- 60 X 15mm 페트리 접시에 장소 무균 스틸 메쉬 화면. 하나의 단위 조직 샘플 당이 필요합니다.
- 각 요리에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 5 ML을 추가합니다. 얼음 요리세요.
- CO 2와 쥐를 안락사시켜야.
- 분해 표면에 보안 마우스, 최대 직면하고 복부 쪽. 살균에 대한 70 %의 에탄올과 및 모피는 아래 헝클어되어 있는지 확인하는 스프레이 마우스.
- 수술 가위를 사용, 그냥 성기 위의 복부 피부에 복부 절개를하여 절개를 시작합니다. 턱에 절개 위쪽을 연장합니다.
- 중간 선에서 모든 다리를 따라 절개를 확장합니다. 느슨한 피부를 당겨하고 분해 표면에 내려 핀.
- thymus를 수확 :
- 절개을 할 수있는 흉골의 하단 끝을 들어 봐요.
- 간을 피 갈비를 분리하고 각 측면에 갈비를 절감 가로막을 잘라. 폐와 심장을 피하기 위해 관리하고, 각 쪽의 흉곽 위쪽으로 자른다.
- 흉곽을 다시 집게로 부드럽게 당긴다. thymus은 심장 위에있는 흰색 bilobed 기관이다. 엽 (叶)의 하단을 파악하기 위해 포셉의 평면 가장자리를 사용하여 부드럽게 thymus을 뽑아 메쉬 화면에 배치.
- 비장을 수확 :
- 비장은 간 아래에있는 마우스의 복강의 왼쪽에있는 빨간색 서핑 보드 모양의 기관이다.
- 복강에 절개를합니다. 부드럽게 결합 조직을 멀리 감히 두 번째 쌍을 사용 포셉 한 쌍의와 함께 비장을 당겨. 별도의 메쉬 화면에서 비장를 놓습니다.
2. 셀 준비
- 3 ML의 주사기에서 플런저를 사용하여 분쇄만 결합 조직과 지방 유적까지 메쉬 화면에 기관. 요리의 HBSS 세 번으로 메쉬를 씻어. 각 조직 샘플에 대한 새로운 플런저를 사용하십시오.
- 조직을 homogenizing에 대한 다른 옵션은이 방법 대신 사용할 수 있습니다.
- hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 335에서 원심 분리하여 펠렛 세포는 4 ° C.에 5 분을 위해 XG
- 실온에서 10 분을위한 ACK 용해 버퍼 500 μl (0.15 M NH 4 CIA 같으니, 10 MM KHC0 3, 0.1 MM 그렇단이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 Resuspend splenocytes. 20 Resuspend thymocytes는 x 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML (PBS, 1 % FCS, 0.02 % 나트륨 azide)과 얼음에 둔다.
- HBSS의 5 ML을 추가하여 isotonicity에 splenocytes을 반환합니다. 펠렛의 20 원심 분리 및 resuspend로 splenocytes X 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML. 세포가 무균 상태로 유지해야하는 경우, 당신은 무균 RPMI + 10% FCS를 사용할 수 있습니다.
3.유동 세포 계측법에 얼룩 세포
이 프로토콜의 목적은 wildtype (WT)와 HY의 CD4 마우스를 사용하여 긍정적이고 부정적인 선택의 분석을위한 전략을 설명하는 것입니다. 유동 세포 계측법 실험 설계, 획득, 분석에 대한 일반적인 고려 사항의 경우, 우리는 퉁 외하여 우수 리뷰에 독자 참조하십시오. 11
- 나누어지는 4 X 10 96 - 웰 플레이트의 각 잘에 유동 세포 계측법 샘플 당 6 thymocytes뿐만 아니라 보상 제어 당 1 × 10 6 WT splenocytes. 유전자 변형 마우스를 사용하는 경우, 당신은 실험에 컨트롤로 WT 마우스를 포함해야합니다.
- 얼음에 10 분에 anti-CD16/32 (클론 2.4G2)로 세포를 잠복기가 FC 수용체를 차단합니다.
- 5 분에 대해 4 ° C에서 335 XG에서 판을 봐. 뚜껑을 제거하고 한 번 판을 flicking하여 우물에서 액체를 풀다, 세면대에 얼굴을 아래로. FACS 버퍼 200 μl의 각 우물을 Resuspend. 세탁을 반복합니다.
- 아래에 나열된뿐만 당 FACS 버퍼 200 μl에 희석를 기준으로하여 각 항체의 최적 농도를 사용하여 항체 칵테일을 준비합니다. 각 항체의 최적 농도는 긍정적이고 부정적인 인구의 가장 큰 분리를 제공하는 데 필요한 최저 농도로 정의됩니다. 특정 항체에 대한 부정적인 인구가없는 경우, isotype 항체가 포함되어야합니다. 원하는 경우도 당 총 볼륨이 (물론 당 100 μl로 등)를 줄일 수 있습니다.
- WT thymus : 안티 - TCRβ, 안티 CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24
- thymus HY의 CD4 : 안티 - HY TCR (T3.70), 안티 - CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24
CD69 ro와 thymocytes에서 CD69 하이 인구의 더 나은 분리를 얻으려면, 그것은 다음, biotinylated 방지 CD69 주요 항체를 사용하는 것이 좋습니다 보조 fluorochrome - 복합 streptavidin을 포함하는 얼룩. 우리는 UCD5 착색에 대한 SE 같은 전략.
- 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼의 항체 칵테일 200 μl로 세포를 배양.
- 항체 칵테일 착색이 동시에, 하나의 fluorochrome - 복합 항체 각 보상 제어를 얼룩. 이상적으로, 보상 착색은 항체 칵테일에 사용되는 것과 같은 항체을 포함한다. 많은 항원이 assayed되고 나면 그러나, 각각의 항원에 대한 얼룩은 큰 실험에 대한 가능한하지 않을 수 있습니다. 따라서, 항 CD4 또는 안티 CD8 중에 얼룩은 높은 이들 항원의 표현, 또는 보상 비즈의 사용으로 인해 권장합니다. 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼에 청바지. 한 보상 제어 흠없는 둡니다.
- FACS 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
- FACS 버퍼와 FACS 튜브로 전송에 Resuspend 세포.
- 흐름 cytometer에 샘플을 수집. FSC-A의 수집 및에 FSC-W 포함이중 어 차별에 대한 llow.
4. 유동 세포 계측법 데이터 분석 - 비 TCR 트렌스 제닉 마우스
우리는 유동 세포 계측법 데이터 분석을 위해 FlowJo를 사용합니다. 비 TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 2A 그림을 참조하십시오.
- SSC의 "림프구"인구에 전자 게이트에서 FSC-A를 사용합니다.
- "림프구"인구 내에서, 세포 doublets 및 aggregrates을 제외 할 전자 게이트 FSC-W 그냥 ... 인구에 FSC-W에 의해 FSC-A를 사용합니다. 이렇게하면 "중항"문입니다.
- "중항"게이트, CD4의 줄거리 CD8의 이벤트를 사용합니다. DN, DP 지루, DP 밝은에 문을 그려, CD4 그림 2B에 묘사 된대로 + CD8 이오, CD4SP 및 CD8SP 인구.
- CD4SP 및 CD8SP 문에서 CD24 플롯에 의해 TCRβ을 만듭니다. 그림 2C에 도시로 문을 끌기 위해 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다.
- NE를 만듭니다CD69의 TCRβ : "중항"게이트에서 w의 줄거리. 문 A, B, C, D 그림 2D에 도시.을 그립니다
- CD5에 의해 TCRβ : "중항"게이트에서 다른 음모를 만듭니다. 그림 2E에 묘사 된대로 문 I, II, III, IV을 그립니다.이 긍정적 인 선택을 검토의 또 다른 전략이다.
- 문 I, II, III, IV, A, B, C, D (그림 2D, E)에 '중항 "아래에서 DN, DP 지루, DP 밝고 CD4의 정수, CD4SP 및 CD8SP 문을 적용합니다.
- 귀하의 대상 인구에 도달 할 때까지 이후의 각 게이트의 주파수에 의해 오르간 cellularity를 곱하여 특정 하위 집합에있는 셀의 개수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, TCRβ 하이 CD69-CD8SP의 thymocytes의 수는 thymus cellularity X % TCR bhi에 의해 결정됩니다 CD69-(일부 D) X %의 CD8SP.
- 계산은 이미 라이브와 죽은 세포가 그렇게 'lymphoc을 포함하지 않는 고려귀하의 계산 yte "게이트.
5. 유동 세포 계측법 데이터의 분석 - TCR 트렌스 제닉 마우스
TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 3A 그림을 참조하십시오.
- 단계 이전 섹션에서와 같이 4.1 및 4.2을 따르십시오.
- "중항"게이트에서 T3.70의 SSC 계획 및 게이트에 의해 T3.70을 만들 + 세포 인구를 항원 특정 T 세포 (그림 3B) 분석 할 수 있습니다. 일부 환경에서는 비 항원 특정 (T3.70-) T 세포의 인구에이 인구를 비교할 관심이있을 것으로 생각됩니다.
- 내 T3.70 + 인구, 추첨 DN, DP, CD4SP 및 CD8SP 문 (그림 3C).
- 거의 T3.70 + 세포가있을 것 같은 WT 제어 샘플에 대해 "중항"게이트에서이 문을 그리거나 T3.70의 문을 만듭니다.
- CD8SP 게이트에서을 만들CD24 플롯으로 T3.70. 네 인구 (그림 3 층)에 셀을 분할 할 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다.
- WT 마우스와 HY의 CD4 마우스의 T3.70 + DP 구획 (그림 4A)의 DP 구획에서 CD69 표현을 묘사 겹쳐 히스토그램을 생성합니다. CD5 표현 (그림 4B)을 검사 반복합니다.
- 4.8에서와 같이 관심의 각 하위 집합에있는 셀의 절대 수를 계산합니다.
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Representative Results
생리 TCR 유전자 변형 모델 및 WT 생쥐에서 긍정적 인 선택 항원 만남 후 DP 지루 무대로 이동하기 전에 DP 밝은 단계에서 시작됩니다. DP 무딘 thymocytes는 CD4SP 또는 CD8SP의 thymocytes (그림 2B)가되기 전에 과도기적 CD4 + CD8에게 이오 단계를 입력합니다. 성숙 SP의 thymocytes은 높은 TCR의 표현과 CD24 (그림 2C)의 손실을 특징으로하고 있습니다. 프로필은 CD69 또는 CD5으로 TCRβ을 검토, 긍정적 인 선택에 결함을 밝힐 수 CD4하여 CD8는 결함이 자리하고있는 곳으로 더 통찰력을 제공 할 수 있지만. CD69과 CD5 모두 이러한 마커 높은 표현을 유도하는 강한 상호 작용과 TCR의 자극 후 upregulated 있습니다.
CD69 음모에 의해 TCRβ에서 문은은 (TCRβ 이오는 CD69-) 사전 선택 DP의 thymocytes의 인구를 나타냅니다, 게이트 B (TCRβ INT CD69 +) TR을 나타냅니다직접 TCR 참여, 게이트 C (TCRβ 안녕하세요 CD69 +) 후 ansitional 인구는 직접 포스트 긍정적 인 선택 세포의 인구를 대표하고, 게이트 D은 (TCRβ 안녕하세요 CD69 -) 세포 (그림 2D)의보다 성숙 인구를 나타냅니다. 게이트 B는 주로 일부 DP 둔하고 CD4와 CD8 + DP 밝은 이오 세포로 구성되어있는 동안 WT 마우스에서 게이트가 A, DP 밝은 세포로 구성되어 있습니다. 게이트 D는 주로 CD4SP과 CD8SP로 구성되어 있습니다 반면, 게이트 C는 주로, DP 지루, CD4 + CD8 ro와 CD4SP 세포로 구성되어 있습니다. 인구 B와 C의 부재는 장애 긍정적 인 선택을 나타내는 수 있습니다. 인구 D 내 CD8SP에 CD4SP의 비율의 변화는 계보 (Lineage) 헌신의 변경을 제안 할 수 있습니다. 인구 C와 D의 손실이 긍정적 인 선택에 따라 생존의 문제가 반영 될 수 있습니다.
CD5으로 TCRβ를 검사하면 다른 전략 t이다전후 긍정적 인 선택 인구를 식별 O. 인구 I (TCRβ 이오 CD5 이오)는 사전 선택 DP의 thymocytes를 나타냅니다과 인구 II는 (TCRβ 이오 CD5 INT) 양의 선택 (그림 2E)를 시작 셀 수 있습니다. 이 인구는 주로 DPbright thymocytes로 구성되어 있습니다. 인구 III는 (TCRβ INT CD5 안녕하세요) 긍정적 인 선택을 진행하는 과정에 thymocytes을 상징하며 주로 DP 둔하고 CD4 + CD8 이오 thymocytes로 구성되어 있습니다. 인구 IV은 (TCRβ 안녕, CD5 하이) 후 긍정적 인 선택 SP의 thymocytes의 주로 구성되어 있습니다. 인구 II 및 III의 장애 세대에 결함이 긍정적 인 선택을 제안합니다. 정상적인 위의 인구에도 불구하고 인구 IV 내의 CD8SP에 CD4SP의 비율의 변화는 계보 (Lineage) 헌신의 변경을 제안 할 수 있습니다. 인구 IV의 부재는 다음과 긍정적 인 selec 감소 생존을 나타낼 수 있습니다기. 예를 들어, 약물 검사에 - / - 긍정적 인 선택은 12 그대로 남아있는 동안 마우스, 결함이있는 CD4SP 차별화 인구 IV, C와 D의 급격한 감소로 연결됩니다. 긍정적 인 선택의 진정한 결함 인구 B, C 및 D 13,14의 손실로 연결 DP 단계, 동안 Bcl11b 불 활성화로 볼 수 있습니다. RasGRP1 - 결핍 생쥐는 인구의 존재의 결과로, 긍정적 인 선택에 이전 결함을 가지고 A (게시되지 않은 데이터).에게
부정적인 선택 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함,이 과정에서 결함이 가장 TCR 유전자 변형 마우스를 사용하여 관찰하고 있습니다. HY의 CD4 마우스에서 유전자 변형 HY TCR을 표현 thymocytes는 단클론 항체 T3.70 (그림 3B)를 감지 할 수 있습니다. HY TCR은 MHC 클래스 ID B에서 제시 한 남성 특정 HY 항원을 인식합니다. 따라서, HY의 CD4 남성 (M) 마우스는 HY TCR의 부정적인 선택을 받다
TCR 유전자 변형 모델 중 하나주의해야 할 점은 유전자 변형 TCR은 thymocyte 개발을 통해 높은 표현된다는 점입니다. 그 결과, 더욱 TCR과 CD69/CD5 표현에 따라 인구를 파악하여 긍정적 인 선택을 특징하기가 어렵습니다. 그러나, CD69과 CD5 표현은 TCR 신호의 강도와 상관 관계 않습니다. WT 생쥐에서 대부분의 DP의 thymocytes는 pMHC의 TCR 참여가 필요합니다 긍정적이거나 부정적인 선택을 받아야하지 않으며, 따라서 CD69 또는 CD5를 upregulate하지 않습니다. HY의 CD4의 F 마우스는 WT (그림 4A)에 비해 CD69 + 인구의 증가로 표시 긍정적 인 선택을 받아야 T3.70 + DP의 thymocytes의 큰 인구가 있습니다. 음성 선택은 긍정적 인 선택보다 높은 선호도 TCR의 자극을 포함,이 방법은 HY의 CD4 M 쥐 T3.70 + DP의 thymocytes에서 CD69 높은 표현으로 표시되며, 변화 O의 결과오른쪽에 F 히스토그램 피크. 비슷한 트렌드가 CD5 표현 (그림 4B)로 볼 수 있습니다. , 유전자 조작 생쥐에서 thymic 선택을 분석하는 CD69를 검토하거나 CD5 표현은 결함이 TCR 신호 또는 TCR의 자극 하류 결과로 자리 잡고 여부를 확인할 수 있습니다 때.
그림 1. 실험 프로토콜의 전체 구조.
그림 2. 비 TCR 유전자 변형 마우스에 thymic 선택을 분석. 비 TCR 유전자 변형 마우스에 thymic 선택을 분석 (A) 게이팅 전략. (B) WT thymus의 CD4 프로필로 CD8. (C) TCRβ과 CD24 표현에 의해 SP thymocytes의 성숙을 검토. (D) 긍정적 인 선택의 단계는에 의해 구별 할 수 있습니다TCRβ 표현으로 CD69, CD8 및 각 하위 집합에 프로파일 CD4와 함께. (E) CD5로 TCRβ이 발달 단계를 구분하는 데 사용할 수있는 또 다른 전략은. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. HY의 CD4 마우스에서 thymic 선택을 분석. TCR 유전자 변형 마우스에 thymic 선택을 분석 (A) 게이팅 전략. (B) WT에 HY TCR (T3.70 +), HY CD4 F와 HY CD4 M 쥐를 표현 thymocytes의 주파수. (C) 지정된 마우스의 T3.70 + 인구의 CD4의 프로필로 CD8. 주파수뿐만 아니라, T3.70 + DP (D) 특히 T3.70 + CD8SP (E) thymocytes의 절대 숫자는 부정적인 선택의 중요한 지표입니다. (F)을 검사지정된 마우스의 CD8SP thymocytes의 성숙. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 인증 표시 (B) 총 WT와 T3.70에서 DP의 thymocytes HY의 CD4의 F와 HY의 CD4 M 마우스의 + DP의 thymocytes에서 CD69 (A)와 CD5의 표현.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 비 TCR 유전자 변형과 TCR 유전자 변형 마우스의 양수와 음수 선택을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원의 착색에 대해 설명합니다. 분자 메커니즘의 추가 분석을 위해, 그것은 종종 세포 염색법을 수행 할 필요가 있습니다. 우리는 전사 인자 대부분의 세포 내 단백질과 BD Biosciences의 Foxp3의 얼룩 키트의 BD Biosciences Cytofix / Cytoperm 키트를 사용합니다. 우리는 보통 즉시 염색 후 우리의 샘플을 취득. 그러나, 샘플은 4에서 1 %의 포름 알데히드 ° 어둠 속에서 C로 FACS 버퍼에 밤새 저장할 수 있습니다. 일부 fluorochromes과 항체가 고정와 호환되지 않을 수도 있으니주의하십시오.
긍정적 인 선택의 분석을 위해, 우리는 부정적인 중급, 높은 표현 인구를보다 효율적으로 분리 (그림 2)를 제공 할 수 biotinylated 항 CD69 또는 안티 CD5를 사용하는 것이 좋습니다. 로 대표 결과에 설명이 게이팅 전략은 두 가지가 따라해야 할 수 있습니다와 같은 계보 (Lineage) 노력에서 긍정적 인 선택에 결함을 구분하는 데 도움이됩니다. 성숙 SP의 thymocytes의 생성뿐만 아니라, 긍정적 선택은 IL-7Rα 및 CCR7의 upregulation에 의해 확인 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 마커는 SP의 thymocytes 15,16에 비해 후 선택 DP의 thymocytes에서 낮은 수준에서 표현됩니다. DP 구획 내에서 성숙 단계에 대한 자세한 분석을 위해, 세포 Zap70 표현식은 17 측정 할 수 있습니다. 이 같은 I와 TCRβ X CD5 플롯 (그림 2E)에서 II와 같은 성숙 마커의 유사한 표현으로 그 인구를 시연에 특히 유용 할 수 있습니다, 개발의 다른 단계를 나타냅니다.
HY의 CD4 모델은 유전자 변형 TCR의 긍정적이고 부정적인 선택,뿐만 아니라 생리 표현을 모두 대표의 장점이 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 적용 할 수특정 고려 사항과 다른 TCR 유전자 변형 모델. 항상 항원에 특정한 T 세포 연구를 활성화하기 위해 선택의 유전자 변형 TCR에 대한 항체가 포함되어 있습니다. 일부 분석 들어, 내부 통제 등의 비 특정 인구에 항원 특정 인구를 비교하는 관심이있을 것으로 생각됩니다. 다른 TCR 유전자 변형 모델에 부정적인 선택을 공부한다는 것은 더 고려가 필요합니다. 부정적인 선택이 이루어지는 기간 동안에 thymocyte 개발 단계는 다른 TCR 유전자 변형 모델 사이에 다릅니다. HY의 CD4의 thymocytes는 음수 선택 10,18 (그림 3)에 대한 정확한 판독이며, 따라서 HY 별 CD8SP의 자손 인구의 분석 DP 단계에서 pMHC 결합한다. 부정적인 선택 고전 HY 마우스 19로 DP 전환에 대한 DN 동안 발생하는 경우, 관심의 분석은 항원 특정 DP의 thymocytes의 유무 것입니다. 유비쿼터스 HY 항원에 대한 선택은 thymic에서 발생피질 20. 반면, 조직이 제한된 항원에 대한 부정적인 선택 thymic 모수 (21, 22)에서 발생합니다. OVA 항원 만 thymic 골수, 췌장 23 활성 쥐 인슐린 발기인의 통제하에 표현으로 OT-I RIP-mOva 마우스는 선택의 유형을 요점을 되풀이하다. thymic 피질에서 DP의 thymocytes의 긍정적 인 선택은 먼저 골수, OT-I TCR + CD8SP의 thymocytes는 OT-I 립 - mOva 쥐 24에 성공적으로 부정적인 선택을 나타냅니다 성숙의 부재 (CD24 이오)로 마이그레이션하는 데 필요한 때문입니다.
TCR 유전자 변형 마우스를 사용하여 항원 특정 셀의 많은 인구를 연구 할 수있는의 이점을 가지고 있지만, 잠재적 인주의는 유전자 변형 TCR의 긍정적이고 부정적인 선택을 중재 할 수 제한 리간드에 의한 T 세포 개발을 변경합니다. 헝겊 - 충분한 HY의 CD4 마우스에서 다른주의해야 할 점은 endoge의 공동 표현마음 TCRα 체인 HY TCR + thymocytes의 소수에 긍정적이고 부정적인 선택을 변조 할 수있는 가능성이 있습니다. 이주의해야 할 점은 일반적으로 HY의 CD4 모델에 고유 한 것이 아니라, 오히려 TCR 유전자 변형 모델. 제시 대표 HY의 CD4는 신문 - 충분한 배경에 HY의 CD4 마우스에서 파생됩니다. 자연 속에서 좀 더 복잡한 있지만, 제한된 전구체 주파수의 더 많은 생리적 환경에서 thymocyte 선택을 연구하는 방법에는 여러 가지 방법이 있습니다. 예를 들어, TCR 유전자 변형 및 WT 혼합 골수 chimeras은 항원 특정 thymocyte 전구체 주파수를 줄이기 위해 생성 할 수 있습니다. 또한, 하나는 HY TCR 25 Vb8 체인 또는 전구체 주파수를 제한 할 수있는 OT-I TCR (26)의 VB5 체인으로 만 유전자 변형 TCRβ 체인을 표현하는 쥐를 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 TCRβ 체인은 항원 특정 thymocytes 재의 추적 다양한 내생 TCRα 체인,와 짝되어 있기 때문에pMHC tetramers의 사용을 quires. 이 방법의 한계는 TCR 표현식이 tetramers를 감지 기능을 허용 DP의 thymocytes에 너무 낮은 것입니다. 이 긍정적이고 부정적인 선택으로 이어질 DP의 thymocytes의 분자 메커니즘의 추가 연구를 제한합니다. 최근 pMHC tetramers 및 자기 구슬 농축의 조합가 27 unmanipulated 마우스에 CD4의 작은 항원 특정 인구 + T 세포를 열거하는 데 사용되었습니다.
부정적인 선택은 주로 고유 apoptosis 경로를 통해 자기 반응성 thymocytes의 clonal 삭제에 의해 중재됩니다. Apoptotic thymocytes이 흘리고 caspase-3 세포 염색법을 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 감지 할 수 있습니다. BH3 전용 BCL-2 가족의 BIM은 TCR의 자극 18,28에 대응 thymocytes에서 caspase-3 활성화를위한 필수적입니다. 다른 TCR 유전자 변형 모델에 BIM - 결함 마우스를 횡단하여 우리 연구실은 BIM이 부정적인 selec에 필요한 사실을 발견했습니다여러 제외 선택 메커니즘 18,29의 존재를 나타내는 유비쿼터스 자기 항원 아니라 조직이 제한된 항원에 대항 기. 비슷한 접근법은 thymic 부정적인 선택 30,31의 또 다른 핵심 중재자로 고아 스테로이드 수용체 Nur77을 범인으로 지목하고 있습니다. HY의 CD4 마우스에서 DP의 thymocytes의 전사 분석은 구체적으로 긍정적이고 부정적인 선택 32시 유도 유전자의 목록을 생성하고 있습니다. 이 유전자에 조작 마우스로 여기에 제시된 방법을 적용하면 thymic 선택의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
그것은 주변 면역 구획의 분석과 thymic 선택의 심사를 따르 이상적입니다. 그러나, 중앙과 주변 삭제를 분리하는 것이 어렵습니다. 부정적인 선택은 궁극적으로 autoimmunity의 부재에 의해 반영된다. 그들은 제한이 있지만, TCR 유전자 변형 마우스는에 강력하고 실용적인 방법입니다생리 부정적인 선택을 공부합니다. 특정 유전자의 결핍 생쥐에 교차로 TCR 유전자 변형 마우스는 음수 선택의 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 효과적인 방법입니다. 사실을 파악하는 것이 중요합니다 그러나, 유전자 결함으로 인해 그 주변 염증은 corticosteroids와 크린 시토 킨 7-9에 의해 중재가 아닌 특정 thymocyte 삭제 될 수 있습니다. 이러한 경우, 여기에 제시된 전략은 염증의 발병하기 전에 신생아 생쥐에서 thymi의 분석에 적용 할 수 있습니다. 긍정적 인 선택은, 반면에, 조사에게 이종 교배하는의 문제를 절약하거나 TCR 또는 비 TCR 유전자 변형 모델에서 공부 할 수 있습니다. 긍정적이고 부정적인 선택에 관여 분자의 더 나은 이해는 면역과 면역 결핍 질환의 진단 및 치료를위한 새로운 전략으로 이어질 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 자신의 기술 지원을 빙 장을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구 (걸레-86595)에 대한 캐나다 연구소에 의해 자금을 지원했다. TAB는 CIHR 새로운 탐정과 AHFMR 학술 수 있습니다. 박사와 AIHS 풀 타임 학생이기 - QH는 CIHR 캐나다 대학원 장학금으로 지원됩니다. SAN은 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금으로 지원됩니다. 박사 - AYWS는 NSERC 대학원 장학금으로 지원된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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References
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