Summary

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Published: October 08, 2012
doi:

Summary

Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células T<em> In vivo</em> Usando camundongos geneticamente manipulados em um tipo selvagem ou de fundo do receptor de células T transgênico.

Abstract

Um sistema imunitário saudável requer que as células T respondem a antigénios estranhos, permanecendo tolerante para auto-antígenos. Rearranjo aleatório do receptor de células T (TCR) e loci α β gera um repertório de células T com grande diversidade de especificidade antigénica, tanto a auto-e estrangeiras. A selecção do repertório durante o desenvolvimento do timo é crítico para a geração segura e úteis células T. Defeitos de selecção tímica contribuir para o desenvolvimento de doenças auto-imunes e da imunodeficiência 1-4.

Progenitores de células T do timo entrar como duplamente negativos (DN) timócitos que não expressam CD4 ou CD8 co-receptores. Expressão da αβTCR e ambos os co-receptores ocorre na fase dupla (DP) positivo. Interacção do αβTCR com auto-péptido-MHC (pMHC) apresentado pelas células do timo determina o destino do timócito DP. Interações de alta afinidade levar a seleção negativa e eliminaçãoção de auto-reactivos timócitos. Baixa afinidade interacções resultam na selecção positiva e desenvolvimento de CD4 ou CD8 positivas únicas células (SP) T capazes de reconhecer antigénios estranhos apresentados pelo MHC próprio 5.

Selecção positiva pode ser estudada em ratinhos com um anticorpo policlonal repertório de TCR (tipo selvagem), observando a geração de células T maduras. No entanto, eles não são ideais para o estudo de selecção negativa, o que envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio. Muitos sistemas de modelos têm sido utilizados para estudar a selecção negativa, mas variam na sua capacidade para recapitular eventos fisiológicos 6. Por exemplo, a estimulação in vitro de timócitos falta o ambiente do timo, que está intimamente envolvido na selecção, ao passo que a administração de antigénio exógeno pode levar à supressão não específica de timócitos 7-9. Atualmente, as melhores ferramentas para estudar na seleção negativa vivo são ratos que expressam uma transgenic específica TCR para endógena antígeno próprio. No entanto, muitos modelos clássicos TCR transgénicos são caracterizados pela expressão prematura da cadeia TCRα transgénico no estádio de DN, resultando em prematuro de selecção negativa. O nosso laboratório desenvolveu o HY modelo CD4, no qual a transgénico HY TCRα condicionalmente está expresso na fase de DP, permitindo a selecção negativa para ocorrer durante a transição para DP SP como ocorre em ratinhos de tipo selvagem 10.

Aqui, nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base em examinar selecção positiva e negativa do timo no modelo do rato HY CD4. Enquanto a selecção negativa nos ratos CD4 HY é altamente fisiológico, estes métodos podem também ser aplicados a outros modelos de TCR transgénicas. Nós também irá apresentar as estratégias gerais para a análise de seleção positiva em um repertório policlonal aplicáveis ​​a quaisquer camundongos geneticamente manipulados.

Protocol

Consulte a Figura 1 para um esquema geral do protocolo experimental. 1. Dissecação Coloque tela de malha de aço estéril em 60 15 mm x placa de Petri. Uma unidade é necessária por amostra de tecido. Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para cada prato. Mantenha pratos no gelo. Euthanize ratos com CO 2. Rato seguro para a superfície, dissecção lado ventral para cima. Pulverização do rato co…

Representative Results

Em fisiológicas modelos TCR transgênicos e camundongos WT, a seleção positiva começa na fase DP brilhante antes de passar à fase DP aborrecido após encontro antígeno. Timócitos DP maçantes em seguida, digite um CD4 + fase de transição CD8 lo antes de se tornar CD4SP ou timócitos CD8SP (Figura 2B). Timócitos maduros SP são caracterizados pela expressão de TCR e da elevada perda de CD24 (Figura 2C). Enquanto o CD8 por …

Discussion

O protocolo aqui apresentado pode ser usado para examinar a selecção positiva e negativa, em não-transgénicos TCR e ratinhos transgénicos TCR. Este protocolo descreve a coloração de antigenes de superfície. Para uma análise mais aprofundada dos mecanismos moleculares, é muitas vezes necessário efectuar a coloração intracelular. Nós usamos o BD Biosciences Kit Cytofix / Cytoperm para a maioria das proteínas intracelulares e da BD Biosciences kit de coloração Foxp3 para fatores de transcrição. Nós gera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer Bing Zhang por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-86595). TAB é um CIHR novo investigador e estudioso AHFMR. QH é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação CIHR Canadá – Doutorado e um Studentship tempo inteiro AIHS. SAN é apoiado por uma Rainha Elizabeth II de Bolsas de Estudo de Pós-Graduação. AYWS é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação NSERC – Doutorado.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
HyClone Hank’s balanced salt solution Thermo Scientific SH30030.02
Metal mesh screens Cedarlane CX-0080-E-01
Petri dishes (60 x 15 mm) Fisher Scientific 877221
Syringes (3 ml) BD Biosciences 309657
Conical tubes (15 ml) Sarstedt 62.554.205
Microscope Zeiss – Primo Star 415500-00XX-000
Hemocytometer Hausser Scientific 3110
96-well plate Sarstedt 82.1582.001
Multichannel pipette Fisherbrand 21-377-829
Fetal calf serum PAA A15-701
Phosphate buffered saline Fisher Scientific SH3025802
Sodium azide IT Baker Chemical Co. V015-05
FcR blocking reagent Clone 2.4G2
Anti-mouse HY TCR eBioscience XX-9930-YY* Clone T3.70
Anti-mouse CD4 eBioscience XX-0042-YY* Clone RM4-5
Anti-mouse CD8α eBioscience XX-0081-YY* Clone 53-6.7
Anti-mouse CD24 eBioscience XX-0242-YY* Clone M1/69
Anti-mouse TCRβ eBioscience XX-5961-YY* Clone H57-597
Anti-mouse CD69 Biotinylated eBioscience 13-0691-YY* Clone H1.2F3
Anti-mouse CD5 Biotinylated eBioscience 13-0051-YY* Clone 53-7.3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY*
Flow cytometer BD Biosciences – FACS Canto 338962
FACS tubes BD Biosciences 352052
Flow cytometry analysis software TreeStar – Flowjo FlowJo v7/9
HyClone RPMI – 1640 medium Thermo Scientific SH30027.01

*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

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Cite This Article
Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (68), e4269, doi:10.3791/4269 (2012).

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