Summary
本文介绍了一种方法，由哪一个可以模仿
Abstract
我们描述了整个果蝇大脑的体外培养的方法。这可以被用来作为一个调查，让急性药物干预和细胞过程的实时成像的细胞生物学和中央大脑结构的发展对位慢性遗传操作。由于该技术的一个例子，以前的工作，从我们的实验室1显示了先前未知的亚车厢之间的果蝇中央脑的神经轴突轴突和somatodendritic的车厢。结果表明基因，称为轴突起始段（AIS）的2，这个车厢的发展依赖于特定的神经元细胞周期蛋白依赖性激酶，Cdk5的。我们在这里展示，野生型果蝇幼虫大脑Cdk5的具体药理抑制剂roscovitine和olomoucine的3 体外处理导致急性肌动蛋白组织的变化，在细胞表面蛋白Fasciclin 2，模仿，缺少Cdk5的活性基因的突变体中看到了更改的本地化。
一个体外培养技术的第二个例子是提供重构胚胎蘑菇体（MB）的变态从幼虫到成虫期间伽玛神经元的连接。蘑菇体是在飞4嗅觉学习和记忆的中心，这些伽玛神经元的修剪在蛹发展的轴突和树突的分支，然后在稍后的时间点，建立了成人的支配模式5重新扩展分行。 MB的这些神经元修剪已通过6个突起的分支本地变性发生，蜕皮激素，类固醇激素引发的一个机制，在蜕皮激素受体B1 7所示，这是依赖于该活动泛素-蛋白酶体系统6。我们对体外培养的方法可以E中审问进一步发展重塑的机制。我们发现，在体外培养的设置，伽玛神经元的MB的概括发展修剪的过程中，同一个时间过程类似体内 。然而，这是必不可少的，之前为了explanting组织细胞的承诺不可逆转的蜕变，等待，直到1.5小时后，形成puparium;导致很少或根本没有文化的变态在对pupariation的发病动物解剖。因此，适当的修改，在体外培养的方法可以应用于研究动态以及中央脑生物学稳态方面。
Protocol
A.媒体的制备
- 准备施耐德过滤消毒的果蝇媒体10％小牛血清和1％青霉素/链霉素补充完整的媒体。
- 媒体应准备新鲜的每一次。此外，新鲜的预冻媒体等份，每次使用前可以解冻。
- 前培养，添加10μg/ ml的胰岛素和2微克/毫升蜕皮媒体。药品准备集中的股票和小等分冻结。不能再冷冻解冻等份。
- 所有的工作方案应保持在25°C。
培养的幼虫脑
1。幼虫大脑的选择和剖析
- 加入500微升至12毫米Millicell小细胞培养插入媒体。解剖大脑将被放置在这些插入方便染色。
- 添加少量的准备媒体到夹层手表的玻璃。
- ü唱小铲，拿起徘徊第三龄幼虫，并将其放置在手表玻璃。 （我们假设， 体外培养方法也同样适用于第一或第二龄幼虫，但我们还没有测试过这个。）
- 控股结束后，幼虫用钳子小心地打开了一个＃5镊子第二对前结束。
- 迅速解剖大脑，保持腹神经索完好。
2。 前解剖的幼虫脑的体外培养
- 使用预湿枪头，小心脑转移到细胞培养插入，与媒体预填充。
- 转让的大脑，在媒体，孵化器在25°C间，直到达到所需的时间点。此方法适用于文化在48小时有效。
- 在8小时更换介质。除此之外，媒体每5-6小时更换一半。
3。药理操纵幼虫脑
这种体外培养的方法可用于药理证实以前在我们的实验室1所示的遗传相互作用。
- 新增100微米roscovitine和100μMolomoucine准备的媒体。
- 解剖的大脑传输到该媒体。
- 文化的大脑在25°24小时。
- 在8小时更换介质。除此之外，取代一半的媒体（毒品），每5-6个小时。
培养的蛹脑
1。夹层蛹的选择
- 纪念瓶/瓶白色的蛹。
- 只有选择，是完全白色的蛹。不应包括任何着色蛹。
- 这个阶段是0小时后Puparium组（APF）的。
- 这些蛹将准备用于解剖后1.5小时标记。这一步是至关重要的，以确保发生在体外发育修剪
2。剖析蛹
- 加入500微升至12毫米Millicell小细胞培养插入媒体。 （解剖大脑将这些刀片放在方便的染色）。
- 一旦已达到所需的时间点，添加少量的准备媒体到夹层手表的玻璃。
- 用一个小的，湿的锅铲，拿起蛹以前解剖标记，并将其放置在手表玻璃。
- 控股的蛹后端的钳子，小心地打开了＃5镊子第二对蛹的情况下，前结束。
- 迅速解剖出脑，保持完整的腹神经索和连接。
3， 前蛹脑解剖的体外培养
- 仔细的脑转移到细胞培养插入，与媒体预填充。
- 转移的大脑，在媒体，孵化器在25°C间，直到所需的时间-Point达到。我们用这种方法长达10小时在文化所示的实验，但它可以扩展到较长时期的观察和治疗，如果需要的话。
- 超过8小时，薏仁更长的时间点，每5-6小时更换媒体。
从这一步，该协议仍然不变，幼虫和蛹。
B.固定解剖大脑
- 一旦达到所需的时间点，消除媒体和添加500μl1X PBS 4％甲醛的0.5％的Triton X-100（PBST）30分钟，15分钟后，更换新鲜的甲醛。
- 确保不要让大脑干更换固定液媒体时。
- 洗掉4个10分钟的1X PBS洗涤，0.5％用TritonX-100（PBST）的甲醛。
C.染色固定脑
- 后甲醛已被洪水冲断，阻断大脑中的1X PBS封闭液，用1％正常1小时山羊血清和1％的牛血清白蛋白。
- 加入封闭液的主要抗体。
- 孵育大脑在4℃过夜
- 第二天早上，洗掉4个10分钟的PBST清洗的主要抗体。
- 加入封闭液的二次抗体。
- 在室温下离开4个小时。
- 洗掉4个10分钟的PBST清洗二次抗体。
D.安装固定和染色的大脑显微镜
- 平衡1小时在Vectashield安装媒体的大脑。
- 安装使用Vectashield安装媒体上的玻璃幻灯片的大脑。
- 安装前盖玻片，放置在大脑两侧的玻璃碎片。这可以防止从被压扁的大脑，同时保持足够样本薄扫描共聚焦显微镜的焦平面。大脑大约面向后安装，以方便查看感兴趣的功能。必要时，脑图像Imaris软件提供的文件和测量的最佳旋转。
- 封盖单透明指甲油。
- 商店滑离光。
E.代表结果
图1显示面板（一）野生型果蝇三龄幼虫的大脑和（B）果蝇表达显性负的Cdk5的衍生工具（Cdk5DN）（康奈尔-克劳利等，2000）。都表达肌动蛋白GFP（绿色）在MB伽玛神经元。如前所述（Trunova 等 ，2011），有一个地区，在近端野生型伽玛失败积累肌动蛋白GFP的神经元轴突，从而呈现出“明确区”（一个支架）， fasciclin 2蛋白（红色）累计最多只能到本区腹侧边界（白色横线）在轴突。在图1（a）第三小组的虚线表示的MB的立场，强调行为在“清区”和其腹侧边境。在苍蝇表达Cdk5DN，明确的肌动蛋白区是缺席（二）Fasciclin 2（FasII）免疫背侧通过该地区的传播。 （请注意，可变数量的水平跨越的MB FasII阳性轴突项目;这些都是不相关的表型）。比例尺代表20微米。
我们用体外培养的方法，我们对待野生型果蝇的roscovitine和olomoucine的，Cdk5的活性抑制剂的组合， 图2显示了第三龄幼虫（一）大脑的控制面板和药物治疗（二）野生型果蝇。苍蝇表达显性负Cdk5的构造，24小时与Cdk5的抑制剂治疗大脑相似，表明损失的肌动蛋白明确的区域特征的转变和在FasII边界（方括号）。白色线条显示的野生的类型FasII边界的位置。比例尺代表20微米。
figu重3显示了从0-10小时薏仁果蝇蘑菇体的代表系列，膜针对性mCD8-GFP（绿色）标记。括号表示花萼，就是MB的树突状预测。变态之前，我们可以看到MB的轴突后背成腹侧窃喜，在厚厚的捆绑，以及密集的树突状乔木（支架）引起的荧光信号的“阴霾”。面板A显示大脑解剖时表示。请注意在该地区的树突修剪括号表示，这样6-8小时，薏仁，树突状信号的阴霾了（虽然轴突信号不受影响）。在B组的大脑进行解剖0小时薏仁之前，内部蜕皮穗（杜鲁门和Riddiford，2002年），并培养体外所示。这些表明没有树突发育修剪;树突的信号，而持续在10小时薏仁。为了规避这一点，蛹被标记在0小时的薏仁，但在1.5小时APF和培养解剖。窗格升C显示了一个从0-10小时薏仁这些果蝇蘑菇体的代表系列。至于非培养的样品中，树突状信号检测不到8小时薏仁。比例尺代表20微米。
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Discussion
慢性组织结构和功能，包括转基因的突变和表达的基因操作，通常会产生直接的影响和后期的间接后果，可以是非常难以分开的组合。补充与药理遗传方法，可以方便的时间后面的表型课程的审讯。例如，这一直是一个强大的方法，在不同的细胞骨架成分的贡献在10 果蝇精子解剖。在当前的例子，它使我们有一个Cdk5的持久性要求保持AIS在果蝇的结构。在其他实验中，我们也有过成功使用药物，目标其他细胞成分，包括蛋白激酶（伊马替尼），肌动蛋白聚合（细胞松弛素，latrunculin和jasplakinolide）和微管（长春花碱和紫杉醇）。
“ 体外培养方法还允许高分辨率发育过程的动态分析。以前的研究已经说明，如短期11日 ，中央脑或长期神经系统的其他部分的成像实时成像， 12胸神经节和视网膜/视神经叶连接13。在这里，虽然我们已集中免疫固定材料的组织分析，我们所描述的方法应该适用于长期的中央大脑的实时成像。例如，适当的修剪轴突和树突的果蝇蘑菇体的发展过程中对中枢神经系统建立正确的连接和支配模式至关重要。此外，在神经组织和重塑的异常被认为到背后的一些神经退行性疾病，包括老年痴呆症的，ALS的和帕金森氏症。“描述的技术在这里，让我们效仿体内重塑果蝇蘑菇体体外突起，在文化。我们能发展到现在的影像变化，遗传变异，药物治疗或环境的变化。
图1 Cdk5DN过度表达造成损失的肌动蛋白的清晰区“和γ-神经元果蝇蘑菇体在在FasII边境转移。 A组显示肌动蛋白GFP（绿色）和FasII（红色）染色的野生型大脑的三个例子，而B组则显示了两个例子大脑过度表达Cdk5DN。注意明确的肌动蛋白区（支架）的损失，并在FasII腹边界（水平白线）（二）转移。在（A）的虚线表示的蘑菇体的位置。比例尺代表20微米。
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图2与药理Cdk5的抑制剂roscovitine和olomoucine的治疗。模仿的过度表达在果蝇蘑菇体Cdk5DN型。图A显示了两个野生型大脑控制，而B组显示两种药物治疗的大脑，培养24小时。注意明确的肌动蛋白区“（支架），（二）转变FasII边境（水平白线）的损失。比例尺代表20微米。
图3 在体内的果蝇蘑菇体树突树突重塑。可以概括体外 。 A组显示大脑解剖在膜结合GFP（绿色）表示和染色时间点。注意失踪树突状信号由8小时薏仁（弥漫，绿色的信号，由支架强调的）。 B组显示在0小时APF和培养离体解剖的大脑体外培养的时间表示。这些大脑表明在体内 （一）看到类似的枝修剪。比例尺代表20微米。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢我们实验室的所有成员，他们的意见，有益的讨论和对手稿的评论。我们还要特别感谢玛尔塔·科赫和Bassem哈桑很好的建议，我们直到1.5小时薏仁前等待解剖大脑重塑实验培养。我们也感谢他们的共聚焦显微镜的使用在NHGRI成像设施。 NINDS的院内研究计划，国立卫生研究院（Z01 NS003106）“基本法”神经科学计划支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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