前全体体内培养，发展的果蝇大脑
Summary
本文介绍了一种方法，由哪一个可以模仿<em>在体内</em>发展<em>果蝇</em>在一个蘑菇体<em>体外</em>文化系统。
Abstract
我们描述了整个果蝇大脑的体外培养的方法。这可以被用来作为一个调查，让急性药物干预和细胞过程的实时成像的细胞生物学和中央大脑结构的发展对位慢性遗传操作。由于该技术的一个例子，以前的工作，从我们的实验室1显示了先前未知的亚车厢之间的果蝇中央脑的神经轴突轴突和somatodendritic的车厢。结果表明基因，称为轴突起始段（AIS）的2，这个车厢的发展依赖于特定的神经元细胞周期蛋白依赖性激酶，Cdk5的。我们在这里展示，野生型果蝇幼虫大脑Cdk5的具体药理抑制剂roscovitine和olomoucine的3 体外处理导致急性肌动蛋白组织的变化，在细胞表面蛋白Fasciclin 2，模仿，缺少Cdk5的活性基因的突变体中看到了更改的本地化。
一个体外培养技术的第二个例子是提供重构胚胎蘑菇体（MB）的变态从幼虫到成虫期间伽玛神经元的连接。蘑菇体是在飞4嗅觉学习和记忆的中心，这些伽玛神经元的修剪在蛹发展的轴突和树突的分支，然后在稍后的时间点，建立了成人的支配模式5重新扩展分行。 MB的这些神经元修剪已通过6个突起的分支本地变性发生，蜕皮激素，类固醇激素引发的一个机制，在蜕皮激素受体B1 7所示，这是依赖于该活动泛素-蛋白酶体系统6。我们对体外培养的方法可以E中审问进一步发展重塑的机制。我们发现，在体外培养的设置，伽玛神经元的MB的概括发展修剪的过程中，同一个时间过程类似体内 。然而，这是必不可少的，之前为了explanting组织细胞的承诺不可逆转的蜕变，等待，直到1.5小时后，形成puparium;导致很少或根本没有文化的变态在对pupariation的发病动物解剖。因此，适当的修改，在体外培养的方法可以应用于研究动态以及中央脑生物学稳态方面。
Protocol
Discussion
慢性组织结构和功能，包括转基因的突变和表达的基因操作，通常会产生直接的影响和后期的间接后果，可以是非常难以分开的组合。补充与药理遗传方法，可以方便的时间后面的表型课程的审讯。例如，这一直是一个强大的方法，在不同的细胞骨架成分的贡献在10 果蝇精子解剖。在当前的例子，它使我们有一个Cdk5的持久性要求保持AIS在果蝇的结构。在其他实验中，我?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢我们实验室的所有成员，他们的意见，有益的讨论和对手稿的评论。我们还要特别感谢玛尔塔·科赫和Bassem哈桑很好的建议，我们直到1.5小时薏仁前等待解剖大脑重塑实验培养。我们也感谢他们的共聚焦显微镜的使用在NHGRI成像设施。 NINDS的院内研究计划，国立卫生研究院（Z01 NS003106）“基本法”神经科学计划支持这项工作。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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