La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains
Summary
Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter<em> In vivo</em> Le développement de la<em> Drosophila</emCorps pédonculé> dans un<em> Ex vivo</emSystème de culture>.
Abstract
Nous décrivons une méthode pour la culture ex vivo du cerveau chez la drosophile entiers. Ceci peut être utilisé comme un contrepoint à des manipulations génétiques chroniques pour étudier la biologie cellulaire et le développement des structures cérébrales centrales en permettant des interventions pharmacologiques aigus et d'imagerie en direct des processus cellulaires. Comme un exemple de la technique, avant de travailler à partir de notre laboratoire 1 a montré que d'un compartiment non comptabilisé antérieurement subcellulaire se situe entre les compartiments axonaux et somato d'axones du cerveau chez la drosophile centrale. Le développement de ce compartiment, appelé le segment initial de l'axone (AIS) 2, a été montré génétiquement dépendre de la kinase spécifique des neurones cycline-dépendantes, Cdk5. Nous montrons ici que le traitement ex vivo du cerveau chez la drosophile de type sauvage larvaires avec la roscovitine Cdk5-pharmacologique spécifique et les inhibiteurs de olomoucine 3 provoque des changements dans l'organisation aigus actine, etdans la localisation de la protéine de surface cellulaire Fasciclin 2, qui imitent les changements observés chez les mutants qui n'ont pas Cdk5 activité génétiquement.
Un deuxième exemple de la technique de culture ex vivo est prévu pour le remodelage des connexions du corps champignons embryonnaire (MB) des neurones gamma lors de la métamorphose de la larve à l'adulte. Le corps du champignon est le centre de l'apprentissage olfactif et de la mémoire chez la mouche 4, et ces neurones gamma élaguer leurs branches axonales et dendritiques au cours du développement nymphal et puis re-branches s'étendent à un instant plus tard, pour établir le modèle innervation adulte 5. La taille de ces neurones de la MB a été démontré que la dégénérescence se produire via des branches locales neurites 6, par un mécanisme qui est déclenchée par l'ecdysone, une hormone stéroïde, agissant au niveau du récepteur d'ecdysone B1 7, et qui dépend de l'activité de la système ubiquitine-protéasome 6. Notre méthode de culture ex vivo peut be utilisé pour interroger davantage le mécanisme de remodelage de développement. Nous avons constaté que dans le cadre de la culture ex vivo, les neurones gamma de la MB a récapitulé le processus d'élagage de développement avec une évolution similaire à celle in vivo. Il était essentiel, cependant, attendre 1,5 heures après la formation puparium avant explantation du tissu pour que les cellules de commettre de façon irréversible à la métamorphose; la dissection des animaux au début de la nymphose a conduit à la métamorphose peu ou pas dans la culture. Ainsi, moyennant des modifications appropriées, l'approche ex vivo de la culture peut être appliquée à l'étude dynamique ainsi que les aspects de l'état d'équilibre la biologie du cerveau central.
Protocol
Discussion
Chroniques les manipulations génétiques de la structure des tissus et la fonction, y compris les mutations et l'expression des transgènes, produisent typiquement une combinaison d'effets immédiats et tardifs conséquences indirectes qui peuvent être très difficiles à séparer. En complément des méthodes génétiques à la pharmacologie peut faciliter les interrogatoires de l'évolution dans le temps derrière un phénotype. Par exemple, cela a été une approche puissante pour disséquer les c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour leurs conseils, discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Nous aimerions également remercier particulièrement Marta Koch et Bassem Hassan pour la suggestion excellente que nous attendre 1,5 heures CSA avant la dissection des cerveaux pour la culture dans les expériences de rénovation. Nous remercions également le centre d'imagerie NHGRI pour l'utilisation de leur microscope confocal. Ce travail a été soutenu par le Programme des neurosciences fondamentales du programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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