全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養
Summary
この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。<emin vivoでの></emの>開発<em>ショウジョウバエ</emで>キノコ体<em> ex vivoで</em>培養系。
Abstract
我々は全体のショウジョウバエの脳のex vivoで培養する方法を説明します。これは急性の薬理学的介入と細胞プロセスのライブイメージングを可能にすることにより、細胞生物学と中央脳構造の開発を調査するための慢性的な遺伝子操作に対位法として使用することができます。技術の一例として、我々の研究室1から前の仕事は、以前に認識されていない細胞内コンパートメントは、 ショウジョウバエ中枢脳の軸索の軸索と細胞体のコンパートメントの間にあることが示されている。軸索起始部（AIS）2と呼ばれるこの区画の開発は、ニューロン特異的サイクリン依存性キナーゼ、Cdk5を依存するように遺伝的に示された。私たちは、Cdk5を特異的薬理学的阻害剤ロスコビチンとオロモウシン3野生型のショウジョウバエの幼虫の脳のex vivoでの治療はアクチン組織の急性変化を引き起こすこと、およびここに示す遺伝的にCdk5を活性を欠く変異体では見られた変化を模倣する細胞表面タンパク質Fasciclin 2の局在インチ
ex vivoでの培養技術の第二の例は、幼生から成体への変態期胚のキノコ体（MB）γニューロンの接続の改造のために提供されています。キノコ体は嗅覚学習とフライ4のメモリの中心であり、これらのγニューロンは成体の神経支配パターン5を確立するために後でタイムポイントでの再拡張に分岐して蛹開発中に、その軸索と樹状突起の枝を剪定します。 MBのこれらのニューロンのプルーニングは、エクジソン受容体B1 7で演技、エクジソン、ステロイドホルモンによって引き起こされるメカニズムによって、神経突起の分岐6のローカル変性を介して起こることが示され、それがの活性に依存しているされていますユビキチン-プロテアソームシステム6。 ex vivoでの培養の我々の方法は、bができますeはさらに発達リモデリングのメカニズムを調べるために使用されます。我々は、ex vivoで培養設定では、MBのγニューロンは in vivoと同様の時間経過とともに発達剪定の過程をrecapitulatedことがわかった。それは変態と不可逆的にコミットするために細胞ために組織をexplanting前蛹殻形成後1.5時間まで待つことが、不可欠であった。pupariation開始時の動物の解剖は、培養中のほとんど、あるいはまったく変態につながった。したがって、適切な修正を加えて、ex vivoで培養アプローチは中心的な脳の生物学の定常状態の側面だけでなく、動的な学習に適用することができます。
Protocol
Discussion
突然変異と導入遺伝子の発現を含む組織の構造と機能の慢性的な遺伝子操作は、通常、分離するのは非常に困難である即効性と後期間接的な結果の組み合わせを生成します。薬理学と遺伝学的手法を補完する表現型の背後にある時間経過の取り調べを容易にすることができます。たとえば、これはショウジョウバエの 10の精子形成時に異なる細胞骨格成分の寄与を解剖す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上でのアドバイス、有用な議論やコメントのために我々の研究室のメンバー全員に感謝したい。我々はまた、特に我々が改造実験で培養するための脳を解剖する前に、APF 1.5時間まで待つという優れた提案のためにマルタコッホとBassemハッサンに感謝します。我々はまた、共焦点顕微鏡を使用するためのNHGRIのイメージング機能を感謝します。この作品は、NINDS学内研究プログラムは、NIH（Z01 NS003106）の基本的な神経科学プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
