Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains
Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze waarbij men kunnen nabootsen<em> In vivo</em> Ontwikkeling van de<em> Drosophila</em> Paddestoel lichaam in een<em> Ex vivo</em> Cultuur-systeem.
Abstract
Wij beschrijven een werkwijze voor ex vivo kweken van Drosophila geheel hersenen. Dit kan gebruikt worden als een tegenhanger van chronische genetische manipulaties voor het onderzoeken van de celbiologie en de ontwikkeling van het centrum van hersenstructuren door toe te staan acute farmacologische interventies en live beeldvorming van cellulaire processen. Als voorbeeld van de techniek vóór werken ons laboratorium 1 is gebleken dat een eerder opgenomen subcellulair compartiment ligt tussen het axonale en somatodendritisch compartimenten axonen van Drosophila centrale hersenen. De ontwikkeling van dit compartiment, aangeduid als axon eerste segment (AIS) 2 is getoond genetisch afhankelijk van de neuron-specifieke cycline afhankelijke kinase, Cdk5. We laten hier zien dat ex vivo behandeling van wild-type Drosophila larven hersenen met de Cdk5-specifieke farmacologische remmers roscovitine en olomoucine 3 acute veranderingen in het actine organisatie veroorzaakt, enin de lokalisatie van de cel-oppervlakte-eiwit Fasciclin 2, dat de veranderingen gezien in mutanten die Cdk5 activiteit missen genetisch na te bootsen.
Een tweede voorbeeld van de ex vivo cultuur techniek is bedoeld voor herinrichting van de aansluitingen van de embryonale paddestoel lichaam (MB) gamma-neuronen tijdens metamorfose van larve tot volwassen. De paddestoel lichaam is het centrum van olfactorische leren en geheugen in de vlieg 4, en deze gamma-neuronen hun axonale en dendritische takken te snoeien tijdens de pop ontwikkeling en vervolgens weer uit te breiden takken op een later tijdstip bepaald aan de volwassen innervatie patroon 5 vast te stellen. Snoeien van deze neuronen van de MB is aangetoond gebeuren door plaatselijke degeneratie van neurite takken 6, door een mechanisme dat wordt geactiveerd door ecdyson een steroid hormoon, die op de ecdyson receptor B1 7 en is afhankelijk van de activiteit van de ubiquitine-proteasoom-systeem 6. Onze methode van ex vivo kweken kan be gebruikt om verder te ondervragen het mechanisme van ontwikkeling remodeling. We hebben gevonden dat in de ex vivo cultuur instelling gamma neuronen van de MB het proces van ontwikkeling snoeien samengevat een tijdsverloop vergelijkbaar met die in vivo. Het was echter van essentieel belang om tot 1,5 uur na puparium vorming wachten voordat explanteren van het weefsel, zodat de cellen onherstelbaar te zetten voor metamorfose, dissectie van dieren bij het begin van de verpopping leidde tot weinig of geen metamorfose in cultuur. Zo, met de juiste modificatie, kan de ex vivo cultuur aanpak worden toegepast om te studeren dynamische en steady-state aspecten van de centrale hersenen biologie.
Protocol
Discussion
Chronische genetische manipulaties van weefsel structuur en functie, met inbegrip van mutaties en de expressie van transgenen, meestal produceren een combinatie van directe effecten en late indirecte gevolgen dat kan heel moeilijk zijn te scheiden. Als aanvulling op genetische methoden met de farmacologie kan vergemakkelijken ondervraging van de tijd natuurlijk achter een fenotype. Zo is dit een krachtige aanpak voor het ontleden van de bijdragen van verschillende cytoskelet componenten tijdens de spermatogenese i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen alle leden van ons lab bedanken voor hun advies, nuttige discussies en commentaar op het manuscript. We zouden ook bijzonder graag Marta Koch en Bassem Hassan bedanken voor de uitstekende suggestie dat wij tot 1,5 uur APF wachten voordat het ontleden van hersenen voor het kweken van in remodeling experimenten. We danken ook de NHGRI imaging faciliteit voor het gebruik van hun confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door de basis Neuroscience Programma van de NINDS Intramurale Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
