Ex vivo Odling av Hel, Utveckla Drosophila Brains
Summary
Denna artikel beskriver en metod som man kan efterlikna<em> In vivo</em> Utveckling av<em> Drosophila</em> Svamp kropp i en<em> Ex vivo</em> Kultur system.
Abstract
Vi beskriver ett förfarande för ex vivo-odling av hela hjärnor Drosophila. Detta kan användas som en motvikt till kroniska genetiska manipulationer för att undersöka cellbiologi och utveckling av centrala hjärnstrukturer genom att akuta farmakologiska interventioner och levande avbildning av cellulära processer. Som ett exempel på den teknik, före arbeta från vårt laboratorium 1 har visat att en tidigare ej subcellulär avdelning ligger mellan de axonala och somatodendritiska fack axoner av Drosophila centrala hjärnan. Utvecklingen av denna kammare, benämnd axonet initiala segmentet (AIS) 2, visade genetiskt att bero på den nervcellsspecifika cyklinberoende kinas, CDK5. Vi visar här att ex vivo-behandling av vildtyp Drosophila larver hjärnor med CDK5-specifika farmakologiska hämmare roskovitin och olomoucin 3 orsakar akuta förändringar i aktin organisation, ochi lokalisering av det cellytebindande proteinet fasciclin 2, som efterliknar de förändringar som ses i mutanter som saknar aktivitet Cdk5 genetiskt.
Ett andra exempel på ex vivo kulturen tekniken finns för ombyggnad av anslutningar av embryonal svamp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfos från larv till vuxen. Svamp kroppen är centrum för lukt inlärning och minne i gylfen 4, och dessa gamma nervceller beskära sina axonala och dendritiska grenar under puppa utveckling och sedan åter sträcker grenar vid ett senare tidpunkt för att fastställa den vuxna innervation mönstret 5. Beskärning av dessa neuroner i MB har visat sig ske via lokal nedbrytning av neurit grenar 6 genom en mekanism som utlöses av ekdyson, en steroid hormon som agerar på kommissionens ekdysonreceptor B1 7, och som är beroende av aktiviteten hos ubiquitin-proteasom-systemet 6. Vår metod för ex vivo odling kan bE som används för att förhöra ytterligare mekanism utvecklande ombyggnad. Vi fann att i ex vivo-odling inställning rekapitulerade gamma neuroner i MB processen för utvecklande beskärning med ett tidsförlopp liknande det som in vivo. Det var dock viktigt att vänta tills 1,5 timmar efter puparium bildandet före explantation vävnaden för att cellerna att begå irreversibelt till metamorfos, dissektion av djur i början av pupariation ledde till liten eller ingen metamorfos i kultur. Således, med lämplig modifiering kan ex vivo kulturen metod användas för att studera dynamiska och steady state aspekter av centrala hjärnan biologi.
Protocol
Discussion
Kroniska genetiska manipulationer av vävnad struktur och funktion, inklusive mutationer och uttryck av transgener, vanligtvis producera en kombination av omedelbara effekter och sena indirekta konsekvenser som kan vara mycket svåra att separera. Komplettera genetiska metoder med farmakologi kan underlätta förhör av tidsförloppet bakom en fenotyp. Till exempel har detta varit en kraftfull strategi för dissekera bidrag från olika cytoskelettala komponenter under spermatogenes hos Drosophila 10….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka alla medlemmar i vårt labb för sina råd, nyttiga diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Vi vill också särskilt tacka Marta Koch och Bassem Hassan för det utmärkta förslaget att vi väntar tills 1,5 timmar APF innan dissekera hjärnor för odling i remodeling experiment. Vi tackar också NHGRI avbildning anläggning för användningen av deras konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av Basic Neuroscience Program för NINDS Interna Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
