Denna artikel beskriver en metod som man kan efterlikna<em> In vivo</em> Utveckling av<em> Drosophila</em> Svamp kropp i en<em> Ex vivo</em> Kultur system.
Vi beskriver ett förfarande för ex vivo-odling av hela hjärnor Drosophila. Detta kan användas som en motvikt till kroniska genetiska manipulationer för att undersöka cellbiologi och utveckling av centrala hjärnstrukturer genom att akuta farmakologiska interventioner och levande avbildning av cellulära processer. Som ett exempel på den teknik, före arbeta från vårt laboratorium 1 har visat att en tidigare ej subcellulär avdelning ligger mellan de axonala och somatodendritiska fack axoner av Drosophila centrala hjärnan. Utvecklingen av denna kammare, benämnd axonet initiala segmentet (AIS) 2, visade genetiskt att bero på den nervcellsspecifika cyklinberoende kinas, CDK5. Vi visar här att ex vivo-behandling av vildtyp Drosophila larver hjärnor med CDK5-specifika farmakologiska hämmare roskovitin och olomoucin 3 orsakar akuta förändringar i aktin organisation, ochi lokalisering av det cellytebindande proteinet fasciclin 2, som efterliknar de förändringar som ses i mutanter som saknar aktivitet Cdk5 genetiskt.
Ett andra exempel på ex vivo kulturen tekniken finns för ombyggnad av anslutningar av embryonal svamp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfos från larv till vuxen. Svamp kroppen är centrum för lukt inlärning och minne i gylfen 4, och dessa gamma nervceller beskära sina axonala och dendritiska grenar under puppa utveckling och sedan åter sträcker grenar vid ett senare tidpunkt för att fastställa den vuxna innervation mönstret 5. Beskärning av dessa neuroner i MB har visat sig ske via lokal nedbrytning av neurit grenar 6 genom en mekanism som utlöses av ekdyson, en steroid hormon som agerar på kommissionens ekdysonreceptor B1 7, och som är beroende av aktiviteten hos ubiquitin-proteasom-systemet 6. Vår metod för ex vivo odling kan bE som används för att förhöra ytterligare mekanism utvecklande ombyggnad. Vi fann att i ex vivo-odling inställning rekapitulerade gamma neuroner i MB processen för utvecklande beskärning med ett tidsförlopp liknande det som in vivo. Det var dock viktigt att vänta tills 1,5 timmar efter puparium bildandet före explantation vävnaden för att cellerna att begå irreversibelt till metamorfos, dissektion av djur i början av pupariation ledde till liten eller ingen metamorfos i kultur. Således, med lämplig modifiering kan ex vivo kulturen metod användas för att studera dynamiska och steady state aspekter av centrala hjärnan biologi.
Kroniska genetiska manipulationer av vävnad struktur och funktion, inklusive mutationer och uttryck av transgener, vanligtvis producera en kombination av omedelbara effekter och sena indirekta konsekvenser som kan vara mycket svåra att separera. Komplettera genetiska metoder med farmakologi kan underlätta förhör av tidsförloppet bakom en fenotyp. Till exempel har detta varit en kraftfull strategi för dissekera bidrag från olika cytoskelettala komponenter under spermatogenes hos Drosophila 10….
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla medlemmar i vårt labb för sina råd, nyttiga diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Vi vill också särskilt tacka Marta Koch och Bassem Hassan för det utmärkta förslaget att vi väntar tills 1,5 timmar APF innan dissekera hjärnor för odling i remodeling experiment. Vi tackar också NHGRI avbildning anläggning för användningen av deras konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av Basic Neuroscience Program för NINDS Interna Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |