السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة
Summary
وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن يقلد<em> في الجسم الحي</em> تطوير<em> ذبابة الفاكهة</em> هيئة فطر في<em> خارج الحي</em> نظام الثقافة.
Abstract
ونحن تصف طريقة لاستزراع الأحياء السابقين من أدمغة ذبابة الفاكهة بأكملها. ويمكن استخدام هذا بمثابة الطباق إلى التلاعب الوراثي المزمن عن التحقيق في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الهياكل المركزية في المخ من خلال السماح التدخلات الدوائية الحادة والتصوير الحي من العمليات الخلوية. وقد أظهرت كمثال على هذه التقنية، والعمل من قبل مختبر لدينا (1) التي مقصورة غير المعترف بها من قبل التحت خلوية تقع بين حجرات محواري وsomatodendritic من محاور عصبية في الدماغ المركزي ذبابة الفاكهة. وقد تبين في تطوير هذه المقصورة، ويشار إلى هذا الجزء محور عصبي الأولي (AIS) 2، وراثيا تعتمد على كيناز الخلايا العصبية الخاصة التي تعتمد على cyclin، Cdk5. نعرض هنا أن السابقين معاملة المجراة من عقل ذبابة الفاكهة البرية من نوع اليرقات مع roscovitine Cdk5 محددة مثبطات الدوائية وolomoucine 3 يسبب تغيرات حادة في منظمة الأكتين، وفي توطين Fasciclin بروتين على سطح الخلية 2، والتي تحاكي التغيرات ينظر في المسوخ التي تفتقر Cdk5 نشاط وراثيا.
ويرد المثال الثاني من تقنية فيفو ثقافة السابقين لإعادة عرض للاتصالات من هيئة فطر الجنينية (MB) الخلايا العصبية جاما خلال التحول من يرقة إلى الكبار. هيئة فطر هي مركز التعلم والذاكرة الشمية في الذبابة 4، وهذه الخلايا العصبية غاما تقليم فروعها محواري وشجيري خلال تطوير العذراء ومن ثم إعادة تمديد فروع في timepoint في وقت لاحق لتأسيس نمط تعصيب الكبار 5. وقد تبين من تشذيب هذه الخلايا العصبية لجماعة الإخوان المسلمين أن يحدث عن طريق انحطاط المحلية لفروع neurite 6، من خلال الآلية التي يتم تشغيلها بواسطة إكديسون، وهو هرمون الستيرويد، ويتصرف بناء على مستقبلات إكديسون B1 7، والتي تعتمد على نشاط ubiquitin-proteasome نظام 6. يمكن أن أسلوبنا في زراعة المجراة سابقا باستخدام البريد لاستجواب مزيد من آلية إعادة عرض التنموية. وجدنا أن في الإعداد فيفو الثقافة السابق، الخلايا العصبية غاما من جماعة الإخوان المسلمين خصت عملية التقليم التنموية مع دورة الوقت مماثلة لتلك التي في الجسم الحي. كان من الضروري، مع ذلك، إلى الانتظار حتى 1.5 ساعة بعد تشكيل puparium قبل explanting النسيج حتى يتسنى للخلايا لارتكاب لا رجعة فيه إلى التحول؛ تشريح الحيوانات في بداية pupariation أدى إلى تحول ضئيلة أو معدومة في الثقافة. وهكذا، بعد إجراء التعديلات المناسبة، يمكن تطبيق ثقافة المجراة سابقا نهج لدراسة ديناميكية، فضلا عن الجوانب حالة مستقرة في علم الأحياء في الدماغ المركزي.
Protocol
Discussion
التلاعب الوراثي المزمن في بنية الأنسجة وظيفة، بما في ذلك التحولات والتعبير عن الجينات المحورة، وعادة ما تنتج مجموعة من الآثار المباشرة وغير المباشرة في وقت متأخر العواقب التي يمكن أن يكون من الصعب جدا فصل. ويمكن استكمال الطرق الوراثية مع علم الصيدلة تسهيل استجوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جميع أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم، وتقديم المشورة المفيدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن أيضا نود أن نشكر بشكل خاص مارتا كوخ وحسن باسم لاقتراح ممتاز أن ننتظر حتى 1.5 ساعة APF قبل تشريح أدمغة للزراعة في إعادة عرض التجارب. كما نشكر مركز التصوير NHGRI لاستخدام مجهر متحد البؤر بهم. وأيد هذا العمل من قبل برنامج العلوم العصبية الأساسية لبرنامج بحوث ضمن الجدران NINDS، المعاهد الوطنية للصحة (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
