Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann<em> In-vivo-</em> Entwicklung der<em> Drosophila</em> Pilzkörper in ein<em> Ex vivo</em> Kultur-System.
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren zur ex-vivo-Kultivierung von Drosophila ganze Gehirn. Dies kann als Kontrapunkt zu chronischen genetische Manipulationen zur Untersuchung der Zellbiologie und der Entwicklung der zentralen Gehirnstrukturen, indem akute pharmakologische Interventionen und Live-Imaging von zellulären Prozessen verwendet werden. Als ein Beispiel für die Technik, vor aus unserem Labor ein Arbeiten haben gezeigt, dass ein bisher nicht berücksichtigter subzellulären Kompartiment zwischen den Axonen und somatodendritischen Fächer von Axonen des zentralen Drosophila Gehirn liegt. Die Entwicklung dieser Kammer, die als das Axon ersten Segment (AIS) 2, wurde genetisch auf dem Neuronen-spezifischen Cyclin-abhängige Kinase, Cdk5 abhängen gezeigt. Wir zeigen hier, dass Ex-vivo-Behandlung von Wildtyp Drosophila Larve Gehirn mit dem Cdk5-spezifische pharmakologische Inhibitoren Roscovitin und Olomoucin 3 akuten Veränderungen im Aktin-Organisation verursacht, undin Lokalisation des Zelloberflächenprotein Fasciclin 2, die die Änderungen in Mutanten, die Cdk5 Aktivität fehlt genetisch gesehen zu imitieren.
Ein zweites Beispiel für die Ex-vivo-Kultur Technik wird für Umbau der Verbindungen von embryonalen Pilzkörper (MB) Gamma-Neuronen während der Metamorphose von der Larve zum erwachsenen Verfügung gestellt. Der Pilzkörper ist das Zentrum des olfaktorischen Lernen und Gedächtnis in-the-fly 4, und diese Gamma-Neuronen beschneiden ihre Axonen und Dendriten Filialen während der gesamten Entwicklung und dann wieder verlängern Zweige zu einem späteren Zeitpunkt, um die erwachsenen Innervationsmuster 5 zu etablieren. Beschneiden dieser Neuronen des MB hat sich gezeigt, über lokale Degeneration von Neuriten Zweigen 6 auftreten, durch einen Mechanismus, durch Ecdyson, ein Steroidhormon, ausgelöst wird, prüft auf Ecdyson-Rezeptor B1 7, und das ist abhängig von der Aktivität der Ubiquitin-Proteasom-System 6. Unsere Methode der Ex-vivo-Kultivierung kann be verwendet werden, um weiter zu befragen, den Mechanismus der Entwicklungspsychologie Umbau. Wir fanden, dass in der ex vivo-Kultur Einstellung, Gamma-Neuronen des MB den Prozess der Entwicklung Beschneiden rekapituliert mit einem zeitlichen Verlauf ähnlich der in vivo. Es war jedoch wesentlich, um bis 1,5 Stunden nach Puparium Bildung vor Explantation des Gewebes, damit die Zellen irreversibel zu verpflichten, Metamorphose warten; Sezierung von Tieren zu Beginn der Puparium führten zu wenig oder gar keine Metamorphose in der Kultur. So, mit entsprechender Modifikation kann die Ex-vivo-Kultur-Ansatz angewendet, um zu studieren dynamische als auch stationäre zentrale Aspekte der Biologie des Gehirns werden.
Protocol
Discussion
Chronische genetische Manipulationen von Gewebe Struktur und Funktion, einschließlich Mutationen und Expression von Transgenen, erzeugen in der Regel eine Kombination aus sofortiger Wirkung und späten indirekte Folgen, die nur sehr schwer zu trennen sind. Als Ergänzung zu genetischen Methoden können mit Pharmakologie erleichtern Verhör des zeitlichen Verlaufs hinter einem Phänotyp. Zum Beispiel, war dies ein starker Ansatz zum Präparieren der Beiträge der verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts während…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten alle Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Beratung, die hilfreichen Diskussionen und Kommentare zum Manuskript danken. Wir würden uns auch besonders gerne Marta Koch und Bassem Hassan für den ausgezeichneten Vorschlag, dass wir warten, bis 1,5 Stunden vor dem Sezieren APF Gehirne für die Kultivierung im Umbau Experimente danken. Wir danken auch dem NHGRI bildgebenden Einrichtung für die Nutzung ihrer konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der Basic Neuroscience Program der NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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