Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila
Summary
Questo articolo descrive un metodo con il quale si può imitare<em> In vivo</em> Sviluppo del<em> Drosophila</em> Corpo funghi in un<em> Ex vivo</em> Sistema di coltura.
Abstract
Noi descriviamo un metodo per la coltura ex vivo di interi cervelli Drosophila. Questo può essere usato come un contrappunto al croniche manipolazioni genetiche per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo delle strutture cerebrali centrali, consentendo acuti interventi farmacologici e immagini dal vivo di processi cellulari. Come esempio della tecnica, prima lavorare dal nostro laboratorio 1 ha dimostrato che un vano precedentemente non subcellulare compreso tra i vani assonale e somatodendritic di assoni del cervello Drosophila centrale. Lo sviluppo di questo vano, indicato come il segmento assone iniziale (AIS) 2, è stato dimostrato geneticamente dipendere dalla chinasi neurone-specifica ciclina-dipendente, Cdk5. Mostriamo qui che il trattamento ex vivo delle wild-type cervelli larvali di Drosophila con la Cdk5-inibitori farmacologici specifici roscovitine e olomoucine 3 produce modifiche acute nell'organizzazione actina enella localizzazione della proteina Fasciclin superficie cellulare 2, che imitano i cambiamenti visti in mutanti che mancano Cdk5 attività geneticamente.
Un secondo esempio di tecnica di coltura ex vivo è previsto per il rimodellamento dei collegamenti del corpo fungo embrionale (MB) neuroni gamma durante la metamorfosi da larva ad adulto. Il corpo fungo è il centro di apprendimento e la memoria olfattiva in volo 4, e questi neuroni gamma potare i rami assonali e dendritiche durante lo sviluppo pupale e poi ri-rami si estendono in un timepoint tardi per stabilire il modello di adulto innervazione 5. Potatura di questi neuroni del MB è stato verificato tramite degenerazione locale di rami neuriti 6, da un meccanismo che viene attivato da ecdisone, un ormone steroideo, agendo sul recettore B1 ecdisone 7, e che dipende dall'attività del sistema ubiquitina-proteasoma 6. Il nostro metodo di coltura ex vivo possono be utilizzato per interrogare ulteriormente il meccanismo di rimodellamento sviluppo. Abbiamo trovato che l'impostazione in coltura ex vivo, neuroni gamma di MB ricapitolato il processo di potatura di sviluppo con un percorso simile a quello che in vivo. È essenziale, tuttavia, attendere 1,5 ore dopo la formazione pupario prima espianto il tessuto affinché le cellule ad impegnarsi irreversibilmente a metamorfosi; dissezione degli animali durante l'insorgenza di pupariation portato a metamorfosi poco o nessun in coltura. Così, con opportune modifiche, l'approccio coltura ex vivo può essere applicato allo studio dinamico così come aspetti allo stato stazionario di biologia cervello centrale.
Protocol
Discussion
Croniche manipolazioni genetiche di struttura del tessuto e funzione, tra cui le mutazioni ed espressione dei transgeni, in genere producono una combinazione di effetti immediati e tardivi conseguenze indirette che possono essere molto difficili da separare. Integrare i metodi genetici con la farmacologia può facilitare l'interrogatorio del corso tempo dietro un fenotipo. Ad esempio, questo è un approccio efficace per sezionare i contributi dei vari componenti citoscheletrici durante la spermatogenesi in <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare tutti i membri del nostro laboratorio per i loro consigli, utili discussioni e commenti sul manoscritto. Vorremmo inoltre particolarmente ringraziare Marta Koch e Bassem Hassan per il suggerimento eccellente che aspettiamo fino a 1,5 ore APF prima sezionare il cervello per la coltura in esperimenti di rimodellamento. Ringraziamo anche la possibilità di imaging NHGRI per l'utilizzo del loro microscopio confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Neuroscienze di base del Programma di NINDS ricerca intramurale, NIH (NS003106 Z01).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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