Ex vivo dyrking av Whole, Utviklingsland Drosophila Brains
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode der man kan etterligne<em> In vivo</em> Utvikling av<em> Drosophila</em> Sopp kroppen i en<em> Ex vivo</em> Kultur system.
Abstract
Vi beskriver en metode for ex vivo dyrkning av hele Drosophila hjerner. Dette kan brukes som et kontrapunkt til kroniske genetiske manipulasjoner for å undersøke cellebiologi og utvikling av sentrale strukturer i hjernen ved at akutte farmakologiske intervensjoner og levende bilder av cellulære prosesser. Som et eksempel på teknikken, før arbeide fra vår lab 1 har vist at en tidligere ikke subcellulære rom ligger mellom de aksonale og somatodendritic avdelinger av axoner i Drosophila sentrale hjernen. Utviklingen av denne avdelingen, kalt axon første segmentet (AIS) 2, ble vist genetisk til å avhenge av nervecellen-spesifikke cyclin-avhengige kinase, Cdk5. Vi viser her at ex vivo behandling av vill type Drosophila larver hjerner med Cdk5-spesifikk farmakologisk hemmere roscovitine og olomoucine tre forårsaker akutte forandringer i aktin organisasjon, ogi lokalisering av celle-overflate protein 2 Fasciclin, som etterligner endringene sett i mutanter som mangler Cdk5 aktivitet genetisk.
Et annet eksempel på ex vivo kulturen teknikk gis for ombygging av tilkoblinger av embryonale sopp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfose fra larve til voksen. Soppen Kroppen er sentrum for olfactory læring og hukommelse i flua 4, og disse gamma nevronene beskjære sine aksonale og dendrittiske grener under pupal utvikling og deretter re-strekker greiner på et senere endepunktet for å etablere den voksne innervasjon mønster fem. Beskjæring av disse nevronene i MB har vist seg å skje via lokale degenerasjon av neurite grener 6, med en mekanisme som utløses av ecdysone, et steroid hormon, som skuespiller i en ecdysone reseptoren B1 7, og som er avhengig av aktiviteten i ubiquitin-proteasome system seks. Vår metode for ex vivo dyrkning kan be brukes til å avhøre ytterligere mekanisme utviklingsmessige remodeling. Vi fant at i ex vivo kulturen innstilling, gamma neurons av MB rekapitulert prosessen med utviklingsmessige beskjæring med en gang kurs lik som in vivo. Det var viktig, men å vente til 1,5 timer etter puparium formasjon før eksplantasjon vevet for at cellene til å forplikte seg irreversibelt til metamorfose, dissekering av dyr ved utbruddet av pupariation ført til liten eller ingen metamorfose i kulturen. Dermed, med passende endring, kan ex vivo kulturen tilnærming brukes til å studere dynamiske så vel som steady state aspekter av sentral hjerne biologi.
Protocol
Discussion
Kroniske genetiske manipulasjoner av vev struktur og funksjon, inkludert mutasjoner og uttrykk for transgener, typisk produsere en kombinasjon av umiddelbare virkninger og sen indirekte konsekvenser som kan være svært vanskelig å skille. Utfyller genetiske metoder med farmakologi kan lette avhør av tiden selvfølgelig bak en fenotype. For eksempel har dette vært en kraftig tilnærming for å dissekere bidrag fra ulike cytoskeletal komponenter under spermatogenesen i Drosophila 10. I dagens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke alle medlemmene i vårt laboratorium for sine råd, nyttige diskusjoner og kommentarer på manuskriptet. Vi vil også spesielt takke Marta Koch og Bassem Hassan for den gode forslag som vi vente til 1,5 timer APF før dissekere hjerner for dyrking i remodeling eksperimenter. Vi takker NHGRI bildebehandling anlegg for bruk av deres confocal mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av Basic Neuroscience Program av NINDS egenutført Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
