A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila
Summary
Este artigo descreve um método pelo qual se pode imitar<em> In vivo</em> Desenvolvimento do<em> Drosophila</em> Corpo cogumelo em uma<em> Ex vivo</em> Sistema de cultura.
Abstract
Nós descrevemos um método para a cultura ex vivo de cérebros inteiros de Drosophila. Isto pode ser utilizado como um contraponto crónicas manipulações genéticas para investigar a biologia celular e desenvolvimento de estruturas cerebrais centrais, permitindo agudas intervenções farmacológicas e de imagiologia vivo de processos celulares. Como um exemplo da técnica, antes trabalhar a partir de nosso laboratório 1 demonstrou que um compartimento anteriormente não reconhecida subcelular situa-se entre os compartimentos axonais e somatodendritic de axónios do cérebro central Drosophila. O desenvolvimento deste compartimento, referido como o segmento de axónio inicial (AIS) 2, foi mostrado geneticamente depender da quinase neurónio específico dependente de ciclina, CDK5. Nós mostramos aqui que o tratamento ex vivo de cérebros de tipo selvagem de Drosophila larvais com a CDK5-farmacológico específico inibidores roscovitina e olomoucina 3 provoca alterações agudas em organização da actina, ena localização da proteína da superfície celular fasciclina 2, que imitam as alterações observadas nos mutantes que não possuem actividade CDK5 geneticamente.
Um segundo exemplo da técnica de cultura ex vivo está prevista a remodelação das ligações do corpo de cogumelo embrionário (MB) neurônios gama durante a metamorfose de larva a adulto. O corpo de cogumelo é o centro da aprendizagem e memória olfativa na mosca 4, e esses neurônios gama podar os galhos axonais e dendríticas durante o desenvolvimento pupal e então re-ramos se estendem em um ponto no tempo mais tarde para estabelecer o padrão de inervação adulto 5. Poda destes neurónios do MB tem sido demonstrado que ocorrem através degeneração local de ramos neurites 6, por um mecanismo que é desencadeada por ecdisona, uma hormona esteróide, actuando no receptor de ecdisona B1 7, e que é dependente da actividade do ubiquitina-proteassoma sistema 6. O nosso método de cultura ex vivo pode be usado para interrogar ainda mais o mecanismo de remodelação de desenvolvimento. Descobrimos que na configuração de ex vivo cultura, os neurónios gama do MB recapitulou o processo de poda do desenvolvimento com um curso de tempo semelhante ao que in vivo. Era essencial, no entanto, de esperar até 1,5 horas após a formação pupário antes explantar o tecido para que as células de cometer irreversivelmente a metamorfose; dissecação dos animais no início da pupariation levou a metamorfose pouca ou nenhuma em cultura. Assim, com a modificação apropriada, a abordagem de cultura ex vivo pode ser aplicado para estudar dinâmica bem como os aspectos de estado estacionário da biologia cérebro central.
Protocol
Discussion
Crónicas manipulações genéticas da estrutura e função dos tecidos, incluindo mutações e expressão de transgenes, produzem tipicamente uma combinação de efeitos imediatos e tardios consequências indirectas que podem ser muito difíceis de separar. Complementando métodos genéticos com a farmacologia pode facilitar o interrogatório do curso de tempo atrás de um fenótipo. Por exemplo, esta tem sido uma poderosa abordagem para dissecar as contribuições dos diferentes componentes do citoesqueleto dura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a todos os membros de nosso laboratório para os seus conselhos, discussões e comentários úteis sobre o manuscrito. Gostaríamos também de agradecer particularmente Marta Koch e Bassem Hassan para a excelente sugestão que esperar até 1,5 horas APF antes de dissecar o cérebro para cultura em experimentos de remodelação. Agradecemos também a facilidade de imagem NHGRI para o uso de seu microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Neurociência Básica do Programa de Pesquisa Intramural NINDS, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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