В этой статье описывается метод, с помощью которого можно имитировать<em> В естественных условиях</em> Развитие<em> Drosophila</em> Гриб тело<em> Бывший естественных условиях</em> Культура системе.
Мы описываем метод культивирования естественных бывший целого мозга дрозофилы. Это может быть использовано в качестве контрапункта к хроническому генетических манипуляций для изучения клеточной биологии и развития центральных структур мозга, позволяя острых фармакологических вмешательств и живые изображения клеточных процессов. В качестве примера техники, до работы из нашей лаборатории 1 показал, что ранее не субклеточных отсек находится между аксонов и somatodendritic отсеков аксонов мозга дрозофилы центральной. Развитие этого отделения, называют начальный сегмент аксона (АИС) 2, было показано генетически зависит от конкретного нейрона циклин-зависимой киназы, Cdk5. Здесь мы покажем, что экс лечение естественных дикого типа Drosophila личиночной мозги Cdk5 конкретных фармакологических ингибиторов росковитина и olomoucine 3 вызывает резкие изменения в организации актина ив локализации на поверхности клетки белок Fasciclin 2, которые имитируют изменения заметны и в мутантов, которые не имеют Cdk5 деятельности генетически.
Второй пример экс техника культуру естественных предусмотрена реконструкция связи эмбриональных тело гриба (МБ) гамма-нейронов во время метаморфоза личинки и взрослые. Гриб тело является центром обонятельного обучения и памяти в лету 4, и эти гамма-нейронов, обрезать их аксонального и дендритных ветвей в куколки, а затем повторно продлить отрасли на более поздний timepoint установить взрослых картина иннервации 5. Обрезка этих нейронов MB Было показано, что происходит через локальную дегенерация аксонов ветвей 6, с помощью механизма, который срабатывает экдизона, стероидных гормонов, действующие на рецепторы экдизона B1 7, и это зависит от активности убиквитин-протеасомной системы 6. Наш метод бывшего культивирования естественных может бE используется для дальнейшего допроса механизм развития ремоделирования. Мы обнаружили, что в бывшем настройки культуры естественных условиях, гамма-нейронов MB воспроизводятся в процессе развития, сокращение со временем конечно же, как в естественных условиях. Важно, однако, ждать 1,5 часа после пупария до культивирующий в искусственной среде ткани для того, чтобы совершить клетки необратимо метаморфоза, вскрытие животных пупаризации привело к практически без метаморфоз в культуре. Таким образом, при соответствующей модификации, экс подходе культура естественных условиях может быть применен для изучения динамических, а также устойчивый аспекты состояния центральной биологии мозга.
Хронический генетических манипуляций структуру ткани и функции, в том числе мутаций и экспрессии трансгенов, как правило, производят сочетание непосредственного эффекта и позднего косвенные последствия, которые могут быть очень трудно отделить. В дополнение к генетической методы…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить всех членов нашей лаборатории за их советы, полезные обсуждения и замечания по рукописи. Мы также хотели бы особенно хотел бы поблагодарить Марта Кох и Бассем Хасана за отличное предложение, что мы ждем до 1,5 часов APF до вскрытия мозг для культивирования в реконструкции экспериментов. Мы также благодарим объекта NHGRI изображений для использования их конфокальной микроскопии. Эта работа выполнена при финансовой поддержке программы Basic Neuroscience от NINDS Внутренние Программы исследований, NIH (Z01 NS003106).
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |