Экс естественных Культивирование полного Разработка Drosophila Brains
Summary
В этой статье описывается метод, с помощью которого можно имитировать<em> В естественных условиях</em> Развитие<em> Drosophila</em> Гриб тело<em> Бывший естественных условиях</em> Культура системе.
Abstract
Мы описываем метод культивирования естественных бывший целого мозга дрозофилы. Это может быть использовано в качестве контрапункта к хроническому генетических манипуляций для изучения клеточной биологии и развития центральных структур мозга, позволяя острых фармакологических вмешательств и живые изображения клеточных процессов. В качестве примера техники, до работы из нашей лаборатории 1 показал, что ранее не субклеточных отсек находится между аксонов и somatodendritic отсеков аксонов мозга дрозофилы центральной. Развитие этого отделения, называют начальный сегмент аксона (АИС) 2, было показано генетически зависит от конкретного нейрона циклин-зависимой киназы, Cdk5. Здесь мы покажем, что экс лечение естественных дикого типа Drosophila личиночной мозги Cdk5 конкретных фармакологических ингибиторов росковитина и olomoucine 3 вызывает резкие изменения в организации актина ив локализации на поверхности клетки белок Fasciclin 2, которые имитируют изменения заметны и в мутантов, которые не имеют Cdk5 деятельности генетически.
Второй пример экс техника культуру естественных предусмотрена реконструкция связи эмбриональных тело гриба (МБ) гамма-нейронов во время метаморфоза личинки и взрослые. Гриб тело является центром обонятельного обучения и памяти в лету 4, и эти гамма-нейронов, обрезать их аксонального и дендритных ветвей в куколки, а затем повторно продлить отрасли на более поздний timepoint установить взрослых картина иннервации 5. Обрезка этих нейронов MB Было показано, что происходит через локальную дегенерация аксонов ветвей 6, с помощью механизма, который срабатывает экдизона, стероидных гормонов, действующие на рецепторы экдизона B1 7, и это зависит от активности убиквитин-протеасомной системы 6. Наш метод бывшего культивирования естественных может бE используется для дальнейшего допроса механизм развития ремоделирования. Мы обнаружили, что в бывшем настройки культуры естественных условиях, гамма-нейронов MB воспроизводятся в процессе развития, сокращение со временем конечно же, как в естественных условиях. Важно, однако, ждать 1,5 часа после пупария до культивирующий в искусственной среде ткани для того, чтобы совершить клетки необратимо метаморфоза, вскрытие животных пупаризации привело к практически без метаморфоз в культуре. Таким образом, при соответствующей модификации, экс подходе культура естественных условиях может быть применен для изучения динамических, а также устойчивый аспекты состояния центральной биологии мозга.
Protocol
Discussion
Хронический генетических манипуляций структуру ткани и функции, в том числе мутаций и экспрессии трансгенов, как правило, производят сочетание непосредственного эффекта и позднего косвенные последствия, которые могут быть очень трудно отделить. В дополнение к генетической методы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов нашей лаборатории за их советы, полезные обсуждения и замечания по рукописи. Мы также хотели бы особенно хотел бы поблагодарить Марта Кох и Бассем Хасана за отличное предложение, что мы ждем до 1,5 часов APF до вскрытия мозг для культивирования в реконструкции экспериментов. Мы также благодарим объекта NHGRI изображений для использования их конфокальной микроскопии. Эта работа выполнена при финансовой поддержке программы Basic Neuroscience от NINDS Внутренние Программы исследований, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
