Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila
Summary
Este artículo describe un método por el cual se puede imitar<em> En vivo</em> Desarrollo de la<em> Drosophila</em> Cuerpo de hongo en un<em> Ex vivo</em> Sistema de cultivo.
Abstract
Se describe un método para el cultivo ex vivo de cerebros completos de Drosophila. Esto puede ser usado como un contrapunto de crónicas manipulaciones genéticas para investigar la biología celular y el desarrollo de estructuras cerebrales centrales al permitir agudas intervenciones farmacológicas y formación de imágenes en vivo de procesos celulares. Como un ejemplo de la técnica, antes de trabajar de nuestro laboratorio 1 ha demostrado que un compartimiento subcelular no reconocido previamente se encuentra entre los compartimentos axonales y somatodendrítica de los axones del cerebro de Drosophila central. El desarrollo de este compartimiento, referido como el segmento inicial del axón (AIS) 2, se muestra genéticamente a depender de la quinasa neuronal específica dependiente de ciclina, Cdk5. Mostramos aquí que el tratamiento ex vivo de tipo salvaje cerebro de Drosophila larvas con la roscovitina Cdk5 específico de los inhibidores farmacológicos y olomoucina 3 se producen cambios agudos en la organización de la actina, yen la localización de la proteína de la superficie celular fasciclin 2, que imitan los cambios observados en los mutantes que carecen de actividad de Cdk5 genéticamente.
Un segundo ejemplo de la técnica in vivo la cultura ex está prevista la remodelación de las conexiones del cuerpo de setas embrionario (MB), las neuronas gamma durante la metamorfosis de larva a adulto. El cuerpo de hongo es el centro de aprendizaje y la memoria olfativa en la mosca de 4, y estas neuronas gamma podar sus ramas dendrítica y axonal durante el desarrollo de la pupa y luego volver a extender las ramas en un punto de tiempo después para establecer el patrón de inervación de adultos 5. La poda de estas neuronas de la MB se ha demostrado que se producen a través de la degeneración local de ramas neuritas 6, por un mecanismo que se activa por la ecdisona, una hormona esteroide, que actúa en el receptor de ecdisona B1 7, y que es dependiente de la actividad del ubiquitina-proteasoma sistema 6. Nuestro método de cultivo ex vivo puede be utilizan para interrogar mejor el mecanismo de la remodelación de desarrollo. Se encontró que en la configuración de la cultura vivo ex, las neuronas gamma de la MB recapituló el proceso de la poda de desarrollo con un tiempo similar al que en vivo. Es esencial, sin embargo, que esperar hasta 1,5 horas después de la formación pupario antes explantar el tejido a fin de que las células de cometer irreversiblemente a la metamorfosis; disección de animales en el inicio de pupariation llevó a metamorfosis poca o ninguna en cultivo. Así, con las modificaciones apropiadas, el método in vivo cultivo ex puede ser aplicado para estudiar dinámica así como los aspectos de estado estacionario de la biología cerebro central.
Protocol
Discussion
Crónicas manipulaciones genéticas de la estructura del tejido y la función, incluyendo las mutaciones y la expresión de los transgenes, por lo general producen una combinación de efectos inmediatos y finales de las consecuencias indirectas que pueden ser muy difíciles de separar. Como complemento de los métodos genéticos con la farmacología puede facilitar el interrogatorio de la evolución en el tiempo detrás de un fenotipo. Por ejemplo, este ha sido un enfoque de gran alcance para la disección de las …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de nuestro laboratorio para sus consejos, las discusiones y comentarios útiles sobre el manuscrito. También nos gusta especialmente dar las gracias a Marta Koch y Hassan Bassem para la excelente sugerencia que esperar hasta 1,5 horas antes de la disección de los cerebros de la APF para el cultivo en los experimentos de remodelación. Agradecemos también a la instalación de imágenes de NHGRI para el uso de su microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural del NINDS, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
