Summary
We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.
Abstract
Elektrochemische sensoren worden veel gebruikt voor snelle en nauwkeurige meting van bloedglucose en kan worden aangepast voor de detectie van een groot aantal analyten. Elektrochemische sensoren werken door transducing een biologische gebeurtenis erkenning tot een bruikbaar elektrisch signaal. Signaaltransductie vindt plaats door het koppelen van de activiteit van een redox-enzym een amperometrische elektrode. Sensor specificiteit ofwel inherent aan het enzym glucose oxidase in het geval van een glucose sensor, of een product van de koppeling tussen het enzym en een antilichaam of probe.
Hier beschrijven we een elektrochemische sensor testwerkwijze direct detecteren en identificeren van bacteriën. In alle gevallen, de hier beschreven probes DNA oligonucleotiden. Deze methode is gebaseerd op de sandwich hybridisatie van afvang en detector sondes met een doelgroep van ribosomaal RNA (rRNA). De capture probe is verankerd aan het sensoroppervlak, terwijl de detector probe is gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP). Wanneer een substraat zoals 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) werd toegevoegd aan een elektrode met capture-detector-target complexen gebonden aan het oppervlak, wordt het substraat geoxideerd door HRP en verminderd met de werkelektrode. Deze redox cyclus resulteert in shuttling van elektronen door het substraat van de elektrode naar HRP, produceren stroom door de elektrode.
Introduction
Gebruik rRNA als doelmolecuul voor bacteriële detectie en identificatie heeft een aantal voordelen. De overvloed van rRNA in bacteriële cellen voorziet in een gevoeligheidslimiet zo laag als 250 bacteriën per milliliter zonder dat doelamplificatie 1. Bacteriële rRNA bevat unieke soort-specifieke sequenties die toegankelijk zijn voor hybridisatie met DNA probes. Bijgevolg kan een reeks van elektrochemische sensoren worden gebruikt om onbekende bacteriën, waarbij elke sensor is gefunctionaliseerd met een ander species-specifiek capture probe te identificeren. Positieve controle sensoren moeten worden opgenomen voor een synthetisch oligonucleotide doel dat "bruggen" het vangen en sondes detector een interne kalibratie-signaal te creëren.
Elektrochemische sensoren hebben een breed scala van fundamenteel en translationeel onderzoek toepassingen. Bijvoorbeeld, de assay beschreven is gebruikt om het effect van E. nauwkeurig te meten coli groeifase op RRNA en pre-rRNA aantallen kopieën, die van groot belang voor onderzoekers geïnteresseerd in bacteriële fysiologie 2. De gevoeligheid van de elektrochemische sensor assay wordt bepaald door de signaal-ruisverhouding. Een verscheidenheid van signaalversterking en methoden ruisonderdrukking zijn onderzocht. We zien dat verbetering van de chemie van het sensoroppervlak is de sleutel tot het verminderen van niet-specifieke binding van detector probe en / of HRP enzym. Met name is een gemengde monolaag van alkanedithiols en mercaptohexanol gebleken achtergrond beperken door het elektrodeoppervlak geheel behoud toegankelijkheid van de capture probe voor hybridisatie doel 3. Deze oppervlakte chemie behandelingen zijn bijzonder belangrijk voor testen met een complexe biologische monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Functionaliseringen van elektrochemische sensoren
- Bereid de gethioleerde capture probe in een concentratie van 0,05 uM in 300 uM 1,6-hexaandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min . Incubatie van de gethioleerde vangprobe met HDT zodat de thiolgroep op de vangprobe wordt verminderd, wat resulteert in meer consistente resultaten.
- Breng een stroom stikstof tot kale goud 16 sensor-array chip (en) voor 5 sec om vocht te verwijderen en / of deeltjes.
- Breng 6 ul van de HDT-gethioleerde capture probe-mengsel voor de werkelektrode van 16 sensoren van de sensor array en bewaar de sensor chip (s) in een bedekte petrischaal bij 4 ° C overnacht. Gethioleerde vangprobes binden rechtstreeks aan de kale goud elektrode en de HDT handelt om overpacking van de vangprobes te voorkomen en bewaar ze in een verlengde conformatie die hybridisatie bevordert met de doelgroep.
- Devolgende dag was de sensorchip met gedeïoniseerd H2O 2-3 seconden en onder een droge stikstofstroom gedurende 5 sec.
- Breng 6 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (MCH) de werkelektrode van 16 sensoren en incubeer gedurende 50 minuten. Deze en alle volgende sensorchip incubaties worden uitgevoerd in een afgedekte petrischaal bij kamertemperatuur. MCH fungeert als blokkeermiddel, vullen de openingen wanneer de gethioleerde vangprobe of HDT niet aanwezig op het elektrodeoppervlak.
2. Monstervoorbereiding
- Breng 1 ml bacteriekweek in de log fase van groei (OD 600 ≈ 0,1) een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. De bacteriële pellet kan onmiddellijk worden verwerkt of bewaard bij -80 ° C voor later gebruik.
- Grondig resuspendeer de bacteriële pellet in 10 gl 1 M NaOH door toepassing van de pipetpunt het bottom van de microcentrifugebuis en en neer te pipetteren meerdere malen. Incubeer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Neutraliseer het bacteriële lysaat door toevoeging van 50 ui 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, bevattende 2,5% runderserumalbumine (BSA) en 0,25 mM van fluoresceïne gemodificeerde detector probe. Incubeer de geneutraliseerd lysaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Fluoresceïne-gemodificeerde probes detector hybridiseren met bacteriële rRNA-moleculen.
3. Elektrochemische sensor Assay
- Was de MCH van de sensorchip met gedeïoniseerd H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
- Breng 4 pl geneutraliseerd bacterieel lysaat van de werkelektrode van elk van 14 sensoren en incubeer gedurende 15 minuten. Target-detector probe complexen hybridiseren aan geïmmobiliseerd gethioleerde vangprobes.
- Breng 4 pi 1 nM overbruggen oligonucleotide in 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, die 2,5% BSA en 0,25 μ M fluoresceïne-gemodificeerde detector sonde naar 2 positieve controle sensoren (gebruikt voor signaal normalisatie) en incubeer gedurende 15 minuten.
- Was de sensorchip met gedeïoniseerd H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
- Breng 4 ui 0,5 U / ml anti-fluoresceïne-HRP in 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, dat 0,5% caseïne de werkelektrode van 16 sensoren en incubeer gedurende 15 minuten. De anti-fluoresceïne-HRP bindt aan de geïmmobiliseerde fluoresceïne gemodificeerde probes detector.
- Was de sensorchip met gedeïoniseerd H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
- Breng een film goed sticker op het oppervlak van de sensor chip en lading in de sensor chip mount. Pipetteer 50 ul van TMB substraat op alle 16 sensoren en sluit de sensor chip mount.
- Verkrijgen amperometrie en cyclische voltammetrie metingen voor alle 16 sensoren met behulp van het Helios Chiplezer. Amperometrische stroom is proportioneel aan de TMB reduction op de sensor oppervlak (zie figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven een elektrochemische test die gelijk is gestructureerd om een sandwich ELISA. Zoals getoond in figuur 1, doel ribosomaal RNA (rRNA) hybridisatie met capture detector en probes wordt ontwikkeld door een redox reactie gekatalyseerd door HRP geconjugeerd aan anti-fluoresceïne antilichaam fragmenten die binden aan het 3'-fluoresceïne koppeling op de detector probe. Een belangrijk onderdeel van assaygevoeligheid is de oppervlaktechemie van de goudelektrode. Wij hebben gevonden dat een ternaire monolaag bestaande uit gethioleerd capture probes, mercaptohexanol en hexaandithiol verbetert de signaal-ruisverhouding doordat niet-specifieke achtergrond binding van reporter eiwit 3. De assays beschreven gebruiken een GeneFluidics 16 sensorarray chip getoond in figuur 2. Elke sensor in de array bevat drie elektroden werken, referentie-en hulpstoffen, die contactpunten aan de rand van de chip 4. De chip te lezenER heeft pogo pennen die met elkaar verbinden van de contactpunten. De chip lezer dient als een interface voor de sensorarray met een potentiometer gecontroleerd door een computeralgoritme.
Voorbeelden van elektrochemische sensor stroom worden getoond in Figuur 3. Stroom door de sensoren is kunstmatig hoog tijdens de eerste paar seconden na amperometrische meting beginnen door de accumulatie van geoxideerde substraat gedurende de tijd van de toepassing van TMB het sensoroppervlak wordt begonnen de lezer algoritme. Stroom snel bereikt een steady state en nauwkeurige sensor metingen betrouwbaar kan worden verkregen binnen zestig seconden. Sensor assays kenmerkend uitgevoerd in duplo als een interne controle voor sensor variabiliteit. Wij hebben gevonden dat de sensor tot sensor variabiliteit relatief constant, zodat het mogelijk 16 verschillende sensor assays parallel uitvoeren op de GeneFluidics 16-sensor-array chip. Positieve en negatieve controles zijn essentieel. Als positieve controle, nemen we een synthetisch "overbruggende" DNA oligonucleotide dat hybridiseert aan zowel de capture probes en detector en dient als een synthetisch doel van bekende concentratie. Hierdoor resultaten verkregen met de overbruggende oligonucleotide fungeert als interne kalibreringssysteem chip-to-chip variatie te minimaliseren.
Bij het testen van probes en capture detector moet de aantoonbaarheidsgrens worden bepaald door seriële verdunning van een monster van bekende concentratie. Zoals getoond in figuur 4, is er een lineair log-log correlatie tussen monster concentratie en signaaluitgang via dynamische bereik van de assay. De detectiegrens wordt gedefinieerd als de concentratie van doel nodig is om een signaal dat 3,29 standaarddeviaties groter dan het gemiddelde van achtergrondsignalen 5 genereren. Voor de identificatie van bacteriën in een onbekend monster, wordt een panel van relevante afvang en detector probeparen geselecteerd. De keuze van probes is bepaald door de aard van bacteriën verdacht een bepaald type monster. Natuurlijk kan ongebruikelijke bacteriën soms worden gevonden in een monster, dus we raden een eubacteriële sonde pair te worden opgenomen dat de capaciteit heeft om te hybridiseren met geconserveerde rRNA regio's van alle bacteriën. Figuur 5 toont representatieve resultaten voor de monsters met E. coli en K. pneumoniae, die vaak worden aangetroffen in de urine van patiënten met urineweginfectie. Signalen voor de meeste sensoren laag en vergelijkbaar zijn, en deze negatieve resultaten kunnen worden samengevoegd als achtergrondsignaal.
Figuur 1. Schematisch diagram van de elektrochemische sensor assay. Het goud elektrode is bekleed met mercaptohexanol en hexaandithiol en gefunctionaliseerd door toevoeging van gethioleerd DNA oligonucleotide invangingsprobes (blauw). Sandwich hybridization van het doel 16S rRNA met de DNA oligonucleotide capture probe en fluoresceïne-gelabelde DNA oligonucleotide detector probe (rood), resulteert in een complex dat wordt gedetecteerd door toevoeging van anti-fluoresceïne - mierikswortel peroxidase (HRP)-conjugaat en TMB substraat. Amperometrische stroom wordt opgewekt door de redoxcyclus die resulteert uit de oxidatie van TMB door HRP en vermindering van TMB door elektronen van de elektrode.
Figuur 2. . Bacteriële identificatie sensor array en chip mount Elke sensor in de array bestaat uit drie elektroden: een centraal werkende elektrode, een omtrek referentie-elektrode en een extra elektrode voor signaal stabiliseren. De werkende elektroden van elke sensor in de array worden gefunctionaliseerd met een panel van capture probes specifiek voor bacteriën van belang zijnde species (zie Tabel 3) als we ll als EU (eubacterieel) invangingsprobe die hybridiseert met alle bacteriële 16S rRNA-moleculen en een brol "overbruggen" oligonucleotide dat functioneert als positieve controle voor signaal kalibreren. Signaal wordt gemeten door de array in een chip lezer pogo pennen die communiceren met de sensor elektroden contactpunten.
Figuur 3. Amperometrische stroomuitgang tijdens de meting. Amperometrische stroom wordt gemeten in parallel voor alle 16 sensoren in de array. Stroom is aanvankelijk zeer negatief als gevolg van ophoping van geoxideerd TMB substraat voorafgaand aan het aansluiten van de array om de chip lezer en het starten van de meting. Daarna huidige snel stabiliseert en sensoraflezingen worden tegen 60 sec. Elektroden met een grotere negatieve stroom de hoogste signalen.
"Figuur 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Figuur 4. Seriële tienvoudige verdunning van E. coli aan de detectiegrens bepalen. Sensoren werden getest in duplo met seriële tienvoudige verdunningen van een bekende concentratie van E. coli lysaat. Het waargenomen signaal lezingen, uitgezet als zwarte cirkels, werden gebruikt om een geïdealiseerde signaal curve voorspellen. De gepoolde standaarddeviatie over alle replicaten en achtergrondsignaal aan scherpe doelconcentratie werden gebruikt om de detectiegrens (blauwe lijn), gedefinieerd als 3,29 standaardafwijkingen boven achtergrond berekenen.
Figuur 5. Vertegenwoordiger elektrochemische sensor test resultaten voor Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae. E. coli en K. pneumoniae werden getest op reactiviteit met probeparen in tabellen 2 en 3. Reactiviteit met de KE probe paar onderscheidt K. pneumoniae uit E. coli. Het schakelprogramma oligonucleotide (brol) dient als positieve controle en interne kalibratie standaard.
| Probe Naam | Ribosomale Subunit en Woonplaats * | Volgorde |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EU Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabel 2. DNA Oligonucleotide Probe Sequences Pair. Capture (Cap) probes worden gesynthetiseerd met thiol verbindingen (S). Detector (Det) sondes worden gesynthetiseerd met fluoresceïne (F) wijzigingen. Let probeparen betrekking zowel een 5'-gethioleerde vangprobe en een 3'-fluoresceïne gemodificeerde detector probe of 3'-gethioleerde capture probe en een 5'-fluoresceïne gemodificeerde detector probe. De twee EL capture probes worden gemengd vóór gebruik. Om de assay te vereenvoudigen, kunnen probes detector worden toegepast op elke sensor een mengsel zonder significante kruisreactiviteit. KE - Klebsiella en Enterobacter, EK - E.coli en K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Enterobacteriaceae familie, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubacteriële, Brol - Bridging Oligonucleotide. * - Locatie number verwijst naar de afstand vanaf het begin van de 16S en 23S gen.
| Bacteriële Species | Reactieve Probe Pairs |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Enterobacter soorten | KE + EB of EL + EB of KE + EL + EB |
Tabel 3. Erkenning van Bacteriële Species door Probe Pairs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De elektrochemische sensor assay beschreven maakt een snelle detectie van nucleïnezuurdoelen. Sensitiviteit en specificiteit hangen gedeeltelijk van de vrije energie van target-probe hybridisatie, op zijn beurt afhankelijk van de lengte en het GC-gehalte van de opname en probes detector. We meestal uit te voeren de stappen hybridisatie bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) 5, 6. De stappen hybridisatie (3.2 en 3.3) kan worden bij hogere temperaturen in een hybridisatie oven uitgevoerd als de chip wordt geplaatst in een kamer die onder bevochtigd filtreerpapier verdamping 7, 8 voorkomen. Optimale signaal verkregen met capture-detector probe paren die hybridiseren aan aangrenzende plaatsen op het nucleïnezuurdoelwit zonder speling tussen de hybridisatieplaatsen 8. Dit signaal verbetering wordt vermoedt dat het basenpaar stapelen en door het verhogen hybridisatie toegankelijkheid van aangrenzende gebieden, bekend als een "helper probe" effect. Capture-detector probe hybridisatie aan aansluitende gebieden is ook belangrijk omdat alkaline lysis van de bacteriën de fragmentatie van de rRNA 5. Deze methode kan worden toegepast voor detectie van hetzij RNA of DNA targets, met vele klinische en wetenschappelijke toepassingen. Zo moet het mogelijk zijn om deze methode te gebruiken om cellulaire functies die worden gereguleerd door kleine RNAs of antibioticumresistentie gendoelstellingen detecteren dat als ofwel DNA of mRNA te bestuderen. Pre-amplication kan nodig zijn doelen in lage kopie-aantallen te detecteren. Bovendien moet RNAse-remmer monstervoorbereiding tot afbraak potentieel instabiele RNA targets voorkomen worden toegevoegd.
Deze werkwijze heeft verschillende voordelen boven andere werkwijzen voor het detecteren en identificeren van bacteriën. Standaard klinische microbiologie methoden vereisen de groei van bacteriën op agar medium voor kwantificering en toepassing van identificatiemethoden. Groei van bacteriën zichtbare kolonies omvat gewoonlijkincubatie gedurende de nacht, aanzienlijk vertragen van de tijd vanaf specimeninzameling tot rapportage van de resultaten. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling van snellere, moleculaire methoden van opsporen van ziekteverwekkers, waaronder elektrochemische biosensoren 9. Er is echter weinig aandacht besteed aan de prestaties van DNA biosensoren in rauwe biologische monsters. De elektrochemische sensor assay beschreven kunnen direct worden uitgevoerd op serum en urine monsters zonder significant verlies van gevoeligheid 7. Het gebruik van gethioleerd capture probes en de gemengde monolaag beschreven maakt het sensor oppervlak tegen niet-specifieke eiwitopname, behouden gevoeligheid voor ruwe biologische monsters zoals serum of urine 10. Zo weinig als 1 bacteriële cel per sensor (250 bacteriën per milliliter) detecteerbaar, vergelijkbaar met de gevoeligheid van PCR-amplificatietechnieken 1. Verschillende PCR gebaseerde identificatie van bacteriën werkwijzen zijn beschreven 11, 12. Hoewel PCR kan potentieel minder doelmoleculen detecteren dan de elektrochemische assay beschreven, hebben PCR-gebaseerde werkwijzen bereikt beperkt gebruik omdat de hoge aquisitie en / of reagens kosten opzichte van standaard klinische microbiologie methoden. Daarentegen elektrochemische sensoren zijn relatief goedkoop te produceren. Hoewel de elektroden worden vervaardigd door goud sputteren, de hoeveelheid goud per chip is klein door de elektrode dikte slechts 1000 angstrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn uitvinders van octrooien om de beschreven methoden relevant. Een van deze patenten is in licentie gegeven aan Qvella Corporation. BMC en DAH hebben aandelenbelang in Qvella Corporation. VG is de voorzitter van GeneFluidics, dat is de fabrikant van de elektrochemische sensor-array chip, chip mount, en chip lezer in dit document beschreven.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Coöperatieve overeenkomst Award AI075565 (tot DAH) van het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en door de Wendy en Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC is de Judith en Robert Winston Chair in Pediatric Urology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
