We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.
Elektrochemische sensoren worden veel gebruikt voor snelle en nauwkeurige meting van bloedglucose en kan worden aangepast voor de detectie van een groot aantal analyten. Elektrochemische sensoren werken door transducing een biologische gebeurtenis erkenning tot een bruikbaar elektrisch signaal. Signaaltransductie vindt plaats door het koppelen van de activiteit van een redox-enzym een amperometrische elektrode. Sensor specificiteit ofwel inherent aan het enzym glucose oxidase in het geval van een glucose sensor, of een product van de koppeling tussen het enzym en een antilichaam of probe.
Hier beschrijven we een elektrochemische sensor testwerkwijze direct detecteren en identificeren van bacteriën. In alle gevallen, de hier beschreven probes DNA oligonucleotiden. Deze methode is gebaseerd op de sandwich hybridisatie van afvang en detector sondes met een doelgroep van ribosomaal RNA (rRNA). De capture probe is verankerd aan het sensoroppervlak, terwijl de detector probe is gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP). Wanneer een substraat zoals 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) werd toegevoegd aan een elektrode met capture-detector-target complexen gebonden aan het oppervlak, wordt het substraat geoxideerd door HRP en verminderd met de werkelektrode. Deze redox cyclus resulteert in shuttling van elektronen door het substraat van de elektrode naar HRP, produceren stroom door de elektrode.
Gebruik rRNA als doelmolecuul voor bacteriële detectie en identificatie heeft een aantal voordelen. De overvloed van rRNA in bacteriële cellen voorziet in een gevoeligheidslimiet zo laag als 250 bacteriën per milliliter zonder dat doelamplificatie 1. Bacteriële rRNA bevat unieke soort-specifieke sequenties die toegankelijk zijn voor hybridisatie met DNA probes. Bijgevolg kan een reeks van elektrochemische sensoren worden gebruikt om onbekende bacteriën, waarbij elke sensor is gefunctionaliseerd met een ander species-specifiek capture probe te identificeren. Positieve controle sensoren moeten worden opgenomen voor een synthetisch oligonucleotide doel dat "bruggen" het vangen en sondes detector een interne kalibratie-signaal te creëren.
Elektrochemische sensoren hebben een breed scala van fundamenteel en translationeel onderzoek toepassingen. Bijvoorbeeld, de assay beschreven is gebruikt om het effect van E. nauwkeurig te meten coli groeifase op RRNA en pre-rRNA aantallen kopieën, die van groot belang voor onderzoekers geïnteresseerd in bacteriële fysiologie 2. De gevoeligheid van de elektrochemische sensor assay wordt bepaald door de signaal-ruisverhouding. Een verscheidenheid van signaalversterking en methoden ruisonderdrukking zijn onderzocht. We zien dat verbetering van de chemie van het sensoroppervlak is de sleutel tot het verminderen van niet-specifieke binding van detector probe en / of HRP enzym. Met name is een gemengde monolaag van alkanedithiols en mercaptohexanol gebleken achtergrond beperken door het elektrodeoppervlak geheel behoud toegankelijkheid van de capture probe voor hybridisatie doel 3. Deze oppervlakte chemie behandelingen zijn bijzonder belangrijk voor testen met een complexe biologische monsters.
De elektrochemische sensor assay beschreven maakt een snelle detectie van nucleïnezuurdoelen. Sensitiviteit en specificiteit hangen gedeeltelijk van de vrije energie van target-probe hybridisatie, op zijn beurt afhankelijk van de lengte en het GC-gehalte van de opname en probes detector. We meestal uit te voeren de stappen hybridisatie bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) 5, 6. De stappen hybridisatie (3.2 en 3.3) kan worden bij hogere temperaturen in een hybridisatie oven uitgevoerd als de chip wordt geplaatst …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door Coöperatieve overeenkomst Award AI075565 (tot DAH) van het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en door de Wendy en Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC is de Judith en Robert Winston Chair in Pediatric Urology.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
Table 1. Reagents and Equipment. |