Summary
نحن تصف طريقة الكهروكيميائية فحص جهاز استشعار للكشف عن بكتيريا السريع وتحديد الهوية. الفحص ينطوي على مجموعة أجهزة الاستشعار functionalized مع الحمض النووي قليل النوكليوتيد تحقيقات لالتقاط الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) تسلسل أنواع محددة. تهجين شطيرة من الريباسي الهدف مع التحقيق القبض على والفجل البيروكسيداز المرتبطة الحمض النووي للكشف عن قليل النوكليوتيد التحقيق تنتج تيارا تجاه المؤثرات الخارجية قابلة للقياس.
Abstract
وتستخدم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية على نطاق واسع لقياس سريع ودقيق من السكر في الدم ويمكن تكييفها للكشف عن مجموعة واسعة من التحاليل. أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تعمل عن طريق transducing حدثا الاعتراف البيولوجية إلى إشارة كهربائية مفيدة. يحدث نقل الإشارة من قبل اقتران نشاط انزيم الأكسدة والاختزال إلى القطب تجاه المؤثرات الخارجية. خصوصية استشعار إما سمة ملازمة للانزيم، أوكسيديز الجلوكوز في حالة وجود جهاز استشعار الجلوكوز، أو منتج من الربط بين الانزيم والأجسام المضادة أو التحقيق.
هنا، نحن تصف طريقة فحص الاستشعار الكهروكيميائية للكشف عن مباشرة وتحديد البكتيريا. في كل حال، فإن تحقيقات الموصوفة هنا [أليغنوكليوتيد الحمض النووي. ويستند هذا الأسلوب على تهجين شطيرة من التقاط وكشف عن تحقيقات مع الهدف الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي). ويرتكز هذا التحقيق القبض على السطح الاستشعار، في حين يرتبط كشف التحقيق إلى Horseradish البيروكسيديز (HRP). عندما يتم إضافة الركيزة مثل 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) إلى القطب مع التقاط المستهدفة كاشف المجمعات بد أن سطحه، يتأكسد الركيزة التي كتبها HRP وتخفيضها من قبل القطب العمل. هذه النتائج دورة الأكسدة والاختزال في رحلات مكوكية من الإلكترونات من قبل الركيزة من القطب إلى HRP، وتنتج تدفق التيار في القطب.
Introduction
باستخدام الريباسي كما الجزيء المستهدف للكشف عن البكتيريا وتحديد لديها عدد من المزايا. وفرة من الريباسي في الخلايا البكتيرية ينص على حد حساسية منخفضة تصل إلى 250 بكتيريا في المليلتر من دون الحاجة إلى الهدف التضخيم 1. الريباسي البكتيرية يحتوي على تسلسل أنواع محددة الفريدة التي هي في متناول التهجين مع تحقيقات الحمض النووي. وبناء على ذلك، مجموعة من أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا غير معروف، حيث يتم functionalized كل أجهزة الاستشعار مع لجنة التحقيق القبض على أنواع محددة مختلفة. وينبغي أن تدرج أجهزة استشعار مراقبة إيجابية للوصول إلى هدف قليل النوكليوتيد الاصطناعية ان "الجسور" التقاط وكشف عن تحقيقات لإنشاء إشارة المعايرة الداخلية.
أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات البحوث الأساسية ومتعدية. على سبيل المثال، ومقايسة الموصوفة هنا قد استخدمت لقياس بدقة تأثير E. مرحلة النمو القولونية على RRNA والأرقام نسخة ما قبل الريباسي، الذي هو من مصلحة كبيرة للباحثين المهتمين في علم وظائف الأعضاء 2 البكتيرية. يتم تحديد حساسية الفحص الاستشعار الكهروكيميائية بواسطة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تم استكشاف مجموعة متنوعة من تضخيم الإشارات وطرق الحد من الضوضاء. نجد أن تحسين كيمياء سطح جهاز الاستشعار هو المفتاح لخفض ملزم غير محدد من كشف التحقيق و / أو إنزيم HRP. على وجه الخصوص، وقد وجد أحادي الطبقة مختلطة من alkanedithiols وmercaptohexanol للحد من الخلفية التي تغطي سطح القطب أكثر تماما مع الحفاظ على سهولة الوصول للمسبار لالتقاط الهدف التهجين 3. هذه العلاجات الكيمياء السطحية لها أهمية خاصة لفحوصات تشمل عينات بيولوجية معقدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Functionalization من مجسات الكهروكيميائية
- إعداد لجنة التحقيق التقاط thiolated بتركيز 0.05 ميكرومتر في 300 ميكرومتر 1،6-hexanedithiol (HDT)، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.3 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة . حضانة لجنة التحقيق التقاط thiolated مع HDT يضمن أن يتم تقليل مجموعة ثيول على لجنة التحقيق لقطة، مما أدى إلى نتائج أكثر اتساقا.
- تطبيق تيار من النيتروجين إلى عارية الذهب 16 رقاقة الاستشعار مجموعة (ق) لمدة 5 ثوانى لإزالة الرطوبة و / أو الجسيمات.
- تطبيق 6 ميكرولتر من HDT-thiolated التقاط هذا المزيج مسبار إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 من مجموعة أجهزة الاستشعار وتخزين رقاقة الاستشعار (ق) في طبق بيتري المغطاة في 4 درجات مئوية خلال الليل. تحقيقات التقاط Thiolated ربط مباشرة إلى القطب الذهب العارية وHDT يعمل على منع overpacking للتحقيقات القبض والاحتفاظ بها في التشكل الموسعة التي تروج التهجين مع الهدف.
- البعد يوم، وغسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
- تطبيق 6 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.3 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 مم 6-mercapto-1-HEXANOL (صحة الأم والطفل) إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 واحتضان لمدة 50 دقيقة. يتم تنفيذ هذا وجميع حضانات لاحقة رقاقة الاستشعار في طبق بتري مغطاة في درجة حرارة الغرفة. صحة الأم والطفل بمثابة عامل عرقلة، وملء الفجوات في التحقيق حيث التقاط thiolated أو HDT غير موجود على سطح القطب.
2. تحضير العينة
- نقل 1 مل من ثقافة البكتيرية في مرحلة من النمو سجل (OD 600 ≈ 0.1) إلى أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي في XG 16،000 لمدة 5 دقائق. إزالة طاف الثقافة. يمكن معالجة بيليه البكتيرية مباشرة أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
- resuspend بدقة بيليه البكتيرية في 10 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم من خلال تطبيق طرف ماصة للبوتتوم من أنبوب microcentrifuge وpipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان تعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تحييد المحللة البكتيرية عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 2.5٪ البقري ملي ألبومين المصل (BSA) و 0.25 من جهاز كشف التحقيق فلوريسئين معدلة. احتضان المحللة تحييد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فلوريسئين وراثيا للكشف عن تحقيقات هجن مع البكتيرية الجزيئات المستهدفة الريباسي.
3. الكهروكيميائية الفحص الاستشعار
- غسل صحة الأم والطفل من رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
- تطبيق 4 ميكرولتر من تحييد المحللة البكتيرية إلى القطب عمل كل من أجهزة الاستشعار 14 واحتضان لمدة 15 دقيقة. المجمعات تحقيق الهدف كاشف هجن ليجمد تحقيقات التقاط thiolated.
- تطبيق 4 ميكرولتر من 1 نانومتر سد قليل النوكليوتيد في 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 2.5٪ BSA و 0.25 ومو؛ M فلوريسئين وراثيا للكشف عن التحقيق إلى 2 أجهزة الاستشعار مراقبة إيجابية (التي تستخدم لتطبيع إشارة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
- غسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
- تطبيق 4 ميكرولتر من 0.5 U / مل المضادة للفلوريسئين-HRP في 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 0.5٪ الكازين إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 واحتضان لمدة 15 دقيقة. مكافحة فلوريسئين-HRP بربط يجمد فلوريسئين معدلة للكشف عن تحقيقات.
- غسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
- تطبيق الفيلم جيدا ملصقا على سطح رقاقة الاستشعار وتحميله إلى جبل رقاقة الاستشعار. ماصة 50 ميكرولتر من الركيزة TMB على جميع أجهزة الاستشعار 16 وأغلق جبل رقاقة الاستشعار.
- الحصول amperometry والقياسات Voltammetry دوري لجميع أجهزة الاستشعار 16 باستخدام قارئ رقاقة هيليوس. الحالية تجاه المؤثرات الخارجية يتناسب مع معدل TMB Rالاستنباط على السطح الاستشعار (انظر الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تصف مقايسة الكهروكيميائية التي يتم هيكلتها على نحو مماثل لشطيرة ELISA. كما هو مبين في الشكل 1، الهدف الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) التهجين مع التقاط وكشف تحقيقات تم تطويرها من قبل رد فعل الأكسدة التي حفزتها HRP مترافق إلى شظايا الأجسام المضادة لمكافحة فلوريسئين التي تربط إلى 3 'فلوريسئين الربط على كشف التحقيق. عنصرا هاما من حساسية مقايسة هو الكيمياء سطح القطب الذهب. لقد وجدنا أن أحادي الطبقة الثلاثية التي تتكون من مجسات thiolated القبض، mercaptohexanol، وhexanedithiol يحسن بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق الحد من خلفية غير محددة ملزمة للبروتين مراسل 3. المقايسات الموصوفة هنا توظيف GeneFluidics 16 استشعار مجموعة رقاقة هو مبين في الشكل 2. كل من أجهزة الاستشعار في مجموعة تحتوي على ثلاثة أقطاب، والعمل، والإشارة، ومساعدة، التي لديها نقاط اتصال على حافة الشريحة 4. رقاقة قراءةإيه لديه دبابيس بوجو التي تربط مع بعضها من نقاط الاتصال. القارئ رقاقة بمثابة واجهة لمجموعة أجهزة الاستشعار مع الجهد التي تسيطر عليها خوارزمية الكمبيوتر.
وترد أمثلة من تدفق الاستشعار الكهروكيميائية الحالي في الشكل 3. تدفق التيار في أجهزة الاستشعار عالية بشكل مصطنع خلال الثواني القليلة الأولى بعد بدء القياسات تجاه المؤثرات الخارجية بسبب تراكم الركيزة تتأكسد خلال فترة من تطبيق TMB إلى السطح استشعار لبدء خوارزمية قارئ. تدفق التيار بسرعة تصل إلى حالة مستقرة وموثوق بها ويمكن الحصول على قراءات أجهزة الاستشعار دقيقة خلال ستين ثانية. وعادة ما يتم تنفيذ المقايسات الاستشعار في تكرار باعتبارها الرقابة الداخلية للتقلب الاستشعار. لقد وجدنا أن التباين الاستشعار إلى الاستشعار هو ثابت نسبيا، ولذلك فمن الممكن إجراء فحوصات 16 جهاز استشعار مختلف بالتوازي على GeneFluidics 16 رقاقة الاستشعار صفيف. الضوابط الإيجابية والسلبية هي ايسنTIAL. كعنصر تحكم إيجابية، ونحن تشمل الاصطناعية "سد" قليل النوكليوتيد الحمض النووي أن يهجن إلى كل من التقاط وكشف عن تحقيقات ويخدم كهدف الاصطناعية من تركيز معروف. في هذه الطريقة، والنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام وظائف قليل النوكليوتيد سد كعنصر تحكم المعايرة الداخلية للحد من التباين رقاقة إلى رقاقة.
عند اختبار التقاط وكشف تحقيقات، ينبغي أن تحدد الحد من الكشف عن طريق التخفيف المتسلسل لعينة من تركيز معروف. كما هو مبين في الشكل (4)، وهناك ارتباط السجل، سجل خطية بين تركيز العينة والإخراج إشارة على النطاق الديناميكي للمقايسة. يتم تعريف الحد من الكشف عن تركيز الهدف مطلوب لإنشاء وإشارة إلى أن 3.29 الانحرافات المعيارية أكبر من الوسط من الإشارات الخلفية 5. لتحديد البكتيريا في عينة مجهولة، ويتم اختيار لجنة من التقاط ذات الصلة وزوجا مسبار كاشف. اختيار تحقيقات طق يحدده أنواع من البكتيريا يشتبه في نوع معين من العينة. بطبيعة الحال، يمكن أحيانا بكتيريا غير عادية يمكن العثور عليها في أي عينة، ولذا فإننا نوصي بأن زوج التحقيق eubacterial ستدرج أن لديه القدرة على هجن إلى مناطق الريباسي الحفظ من أي بكتيريا. ويبين الشكل 5 ممثل النتائج للعينات التي تحتوي على E. القولونية وK. الرئوية، والتي كثيرا ما وجدت في البول من المرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية. وبالنسبة لمعظم الإشارات من أجهزة الاستشعار وتكون منخفضة مماثلة، ويمكن تجميع هذه النتائج السلبية باعتبارها إشارة الخلفية.
الشكل 1. الرسم التخطيطي للمقايسة الاستشعار الكهروكيميائية. وهي مغلفة القطب الذهب مع mercaptohexanol وhexanedithiol وfunctionalized بواسطة إضافة thiolated DNA قليل النوكليوتيد تحقيقات القبض على (الازرق). ح شطيرةybridization من الهدف 16S الرنا الريباسي مع الحمض النووي قليل النوكليوتيد التحقيق والقبض على فلوريسئين التي تحمل علامات الحمض النووي للكشف عن التحقيق قليل النوكليوتيد (الحمراء)، والنتائج في المعقدة التي تم الكشف عنها بواسطة اضافة المضادة للفلوريسئين - الفجل البيروكسيداز (HRP) والمكورات الركيزة TMB. يتم إنشاء الحالية تجاه المؤثرات الخارجية عن طريق دورة الأكسدة التي تنتج من أكسدة TMB بواسطة HRP والحد من TMB بواسطة الإلكترونات من القطب.
الشكل 2. . البكتيرية مجموعة أجهزة الاستشعار وتحديد وجبل رقاقة الاستشعار في كل مجموعة تتكون من ثلاثة أقطاب: قطب عمل مركزية، والإلكترود المرجعي كفافي وإلكترود المساعدة لتحقيق الاستقرار إشارة. وfunctionalized الأقطاب عمل كل أجهزة الاستشعار في مجموعة مع فريق من تحقيقات التقاط محددة لأنواع الجراثيم من الفائدة (انظر الجدول 3) ونحن ليرة لبنانية بمثابة الاتحاد الأوروبي (eubacterial) التحقيق القبض على أن يهجن لجميع 16S البكتيرية جزيئات الرنا الريباسي وBrOl "سد" قليل النوكليوتيد أن يعمل بمثابة مراقبة إيجابية للمعايرة إشارة. يتم قياس إشارة عن طريق وضع مجموعة في القارئ رقاقة مع دبابيس بوجو تلك الواجهة مع جهاز استشعار نقاط الاتصال الكهربائي.
الشكل (3). يتم قياس الانتاج الحالي تجاه المؤثرات الخارجية أثناء القياس. الحالية تجاه المؤثرات الخارجية بشكل متواز لجميع أجهزة الاستشعار 16 في صفيف. تدفق التيار في البداية سلبية للغاية بسبب تراكم تتأكسد الركيزة TMB قبل ربط مجموعة للقارئ رقاقة وبدء القياس. بعد ذلك، بسرعة الحالي تستقر ويتم تسجيل قراءات أجهزة الاستشعار في 60 ثانية. الأقطاب الكهربائية مع أكبر السلبية الحالية لديها أعلى الإشارات.
"الشكل 4" SRC = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
الشكل 4. مسلسل عشرة أضعاف التخفيف من E. تم اختبار القولونية لتحديد الحد من الكشف. مجسات في تكرار مع مسلسل عشرة أضعاف التخفيفات من تركيز معروف من E. كولاي المحللة. القراءات إشارة لوحظ، كما خططوا الدوائر السوداء، تم استخدامها للتنبؤ منحنى إشارة المثالية. الانحراف المعياري المجمعة لجميع مكررات واستخدمت إشارة الخلفية بأقل تركيز الهدف على حساب الحد من الكشف (الخط الأزرق)، الذي يعرف بأنه 3.29 الانحرافات المعيارية أكثر من الخلفية.
الشكل 5. ممثل الكهروكيميائية استشعار نتائج الفحص لالإشريكية القولونية والكلبسيلا الرئوية. E. القولونية وK. pneumonتم اختبار IAE للتفاعل مع أزواج التحقيق المبينة في الجدولين 2 و 3. للتفاعل مع الزوج التحقيق KE يميز K. الرئوية من E. القولونية. قليل النوكليوتيد سد (BrOl) بمثابة مراقبة إيجابية ومستوى المعايرة الداخلية.
| اسم مسبار | الوحيدات الريباسي والموقع * | تسلسل |
| KE كاب 10M | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE ديت 11m سجلت | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK كاب 15M | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK ديت 15M | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL كاب 17m سجلت | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL كاب 18M | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL ديت 15M | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB كاب 23m سجلت | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB ديت 23m سجلت | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| كاب PM 15M | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| ديت 17m سجلت PM | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA كاب 11m سجلت | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA ديت 14m سجلت | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| الاتحاد الأوروبي GN كاب 19m سجلت | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| ديت 18M الاتحاد الأوروبي | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| BrOl 37M الاتحاد الأوروبي | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
الجدول 2. ويتم تخليق الحمض النووي قليل النوكليوتيد دقق متواليات زوج. التقاط (CAP) تحقيقات مع الروابط ثيول (S). وقد تم تجميع للكشف عن (ديت) تحقيقات مع فلوريسئين (F) التعديلات. لاحظ أن أزواج التحقيق تنطوي إما التحقيق 5'-thiolated التقاط وكشف التحقيق 3'-فلوريسئين وراثيا أو التحقيق التقاط 3'-thiolated وكشف التحقيق 5'-فلوريسئين معدلة. هي تحقيقين التقاط EL مختلطة قبل استخدامها. لتبسيط الفحص، ويمكن تطبيقها للكشف عن تحقيقات لكل جهاز استشعار على شكل مزيج من دون كبير عبر التفاعل. KE - الكلبسيلة الأمعائية و، EK - القولونية وK. الرئوية، EL - E. المذرقية، EB - إنتروبكتريسا الأسرة، PM - P. الرائعة، PA - P. الزنجارية، والاتحاد الأوروبي - Eubacterial، BrOl - سد قليل النوكليوتيد. * - موقع nبني مصفر يشير إلى المسافة من بداية 16S أو الجينات 23S.
| الأنواع البكتيرية | أزواج دقق على رد الفعل |
| كولاي | EK + EB |
| الكلبسيلة الرئوية | KE + + EB EK |
| المتقلبة الرائعة | + EB PM |
| الزائفة الزنجارية | PA |
| الأنواع الأمعائية | KE + EB أو EL + EB أو KE + + EL EB |
الجدول 3. اعتراف من الأنواع البكتيرية بواسطة أزواج التحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فحص جهاز استشعار الكهروكيميائية صفها هنا يمكن الكشف السريع عن الأهداف الحمض النووي. حساسية وخصوصية تعتمد في جزء منها على الطاقة الحرة من التهجين الهدف مسبار، والتي تعتمد بدورها على طول والمحتوى GC من التقاط وكشف تحقيقات. نحن عادة بتنفيذ الخطوات التهجين عند درجة حرارة الغرفة (~ 20 ° C) 5، 6. ومع ذلك، فإن خطوات التهجين (3.2 و 3.3) ويمكن أيضا أن يؤديها في ارتفاع درجات الحرارة في فرن التهجين إذا تم وضع رقاقة في غرفة مغطاة تحتوي على ترطيبها ورقة فلتر لمنع التبخر 7، 8. يتم الحصول على إشارة الأمثل مع أزواج التحقيق القبض على كاشف أن يهجن إلى مواقع مجاورة على الهدف الحمض النووي دون وجود فجوة بين المواقع التهجين 8. ويعتقد أن هذا التعزيز إشارة للعمل من خلال قاعدة بين زوج التراص وعن طريق زيادة إمكانية الوصول التهجين من المناطق المجاورة، والمعروفة باسم "المسبار المساعد تأثير". القبض على كاشف مشكلهه التهجين إلى مواقع مجاورة المهم أيضا بسبب تحلل القلوية للنتائج البكتيريا في تفتيت الهدف الريباسي 5. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لكشف إما RNA أو DNA الأهداف، مع مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية والبحوث. على سبيل المثال ينبغي أن يكون من الممكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة الوظائف الخلوية التي تنظم من قبل الرنا الصغيرة أو للكشف عن المضادات الحيوية أهداف الجينات المقاومة إما إما DNA أو الرنا. قد يكون من الضروري كشف الأهداف حاضرا في أعداد نسخة منخفضة قبل amplication. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تضاف مثبطات ريبونوكلياز خلال إعداد عينة لمنع تدهور أهداف RNA يحتمل أن تكون غير مستقرة.
هذا الأسلوب له مزايا عديدة أكثر من غيرها من أساليب الكشف والتعرف على البكتيريا. طرق علم الأحياء الدقيقة السريرية القياسية تتطلب نمو البكتيريا على وسط آغار لتحديد الكميات وتطبيق طرق تحديد الهوية. نمو البكتيريا إلى المستعمرات مرئية عادة ما ينطويالحضانة بين عشية وضحاها، وتأخير كبير في وقت من جمع العينات إلى الإبلاغ عن النتائج. هناك اهتمام كبير في تطوير أسرع الطرق الجزيئية، من الكشف عن العوامل المسببة للأمراض، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية 9. ومع ذلك، فقد تم إيلاء اهتمام يذكر لأداء أجهزة الاستشعار الحمض النووي في العينات البيولوجية الخام. فحص جهاز استشعار الكهروكيميائية وصفها هنا يمكن القيام بها مباشرة على عينات الدم والبول دون خسارة كبيرة من الحساسية 7. استخدام المجسات التقاط thiolated وأحادي الطبقة المختلطة الموصوفة هنا يجعل سطح استشعار مقاومة للامتصاص البروتين غير محددة، والإبقاء على حساسية في العينات البيولوجية الخام بما في ذلك المصل أو البول 10. عدد قليل من 1 الخلية البكتيرية في الاستشعار (250 بكتيريا في المليلتر) قابلة للكشف، وهو مشابه لحساسية PCR التضخيم تقنيات 1. وقد وصفت عدة طرق تحديد البكتيريا مقرها PCR 11، 12. على الرغم من PCR يمكن الكشف عن احتمال الجزيئات المستهدفة أقل من فحص أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية وصفها هنا، قد حققت على أساس أساليب PCR اعتماد محدودة بسبب اقتناء المعدات العالية و / أو تكاليف كاشف، نسبة إلى طرق علم الأحياء الدقيقة السريرية القياسية. في المقابل، وأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية هي غير مكلفة نسبيا لإنتاج. على الرغم من هي ملفقة من قبل الأقطاب الذهب الاخرق، وكمية من الذهب لكل رقاقة منخفضة لأن سمك القطب هو فقط 1،000 انغستروم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين هي المخترعين على براءات الاختراع ذات الصلة إلى الأساليب المذكورة. وقد تم الترخيص واحدة من هذه البراءات لشركة Qvella. BMC وداه لها حصة في شركة Qvella. VG هو رئيس GeneFluidics، التي هي الشركة المصنعة لأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية رقاقة مجموعة، جبل رقاقة، ورقاقة القارئ وصفها في هذه الورقة.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة الاتفاق التعاوني AI075565 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والتي يندي وصندوق روبي كين للتميز في أبحاث المسالك البولية للأطفال. BMC هو جوديث وروبرت ونستون في كرسي المسالك البولية للأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
