Vi beskriver en elektrokemisk metod sensor analys för snabb bakteriell detektion och identifiering. Analysen omfattar en sensor array med funktionella fånga DNA oligonukleotidsonder för ribosom RNA (rRNA) artspecifika sekvenser. Sandwich hybridisering av mål-rRNA med infångningsproben och en pepparrotsperoxidas-länkad DNA oligonukleotid detektorsonden ger en mätbar amperometriskt ström.
Elektrokemiska sensorer används ofta för snabb och noggrann mätning av blodglukos och kan anpassas för detektion av en mängd olika analyter. Elektrokemiska sensorer fungerar genom att överföra en biologisk erkännande händelse till en användbar elektrisk signal. Signaltransduktion sker genom koppling av aktiviteten av ett redox-enzym till en amperometrisk elektrod. Sensor specificitet är antingen en inneboende egenskap av enzymet, glukosoxidas i fallet med en glukossensor, eller en produkt av bindning mellan enzymet och en antikropp eller prob.
Här beskriver vi en elektrokemisk metod sensor analys för att direkt upptäcka och identifiera bakterier. I varje fall de sonder som beskrivs här är DNA-oligonukleotider. Denna metod är baserad på sandwich-hybridisering av avskiljning och detektor sonder med målet ribosom RNA (rRNA). Den infångande sonden är förankrad till sensorytan, medan detektorn sonden är kopplad till horseradish peroxidas (HRP). När ett substrat, såsom 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) sätts till en elektrod med capture-target-detektor komplexen bundna till dess yta är substratet oxideras av HRP och reduceras av arbetselektroden. Denna redox körcykelresultat i shuttling av elektroner av substratet från elektroden till HRP, producerar strömflöde i elektroden.
Använda rRNA som en målmolekyl för bakteriell detektion och identifiering har ett antal fördelar. Överflödet av rRNA i bakterieceller föreskrivs en känslighetsgräns så lite som 250 bakterier per milliliter utan behov av målamplifiering 1. Bakteriell rRNA innehåller unika artspecifika sekvenser som är tillgängliga för hybridisering med DNA-sonder. Följaktligen kan en uppsättning av elektrokemiska sensorer användas för att identifiera okända bakterier, där varje sensor är funktionaliserad med en annan artspecifik infångningsprob. Positiva-sensorer bör ingå för en syntetisk oligonukleotid mål som "broar" avskiljning och sonder detektor för att skapa en intern kalibrering signal.
Elektrokemiska sensorer har ett brett utbud av bastjänster och translationell forskning tillämpningar. Till exempel beskrivs analysen här har använts för att exakt mäta effekten av E. coli tillväxtfas på rrnA och pre-rRNA kopiera nummer, vilket är av stort intresse för forskare som är intresserade av bakteriell fysiologi 2. Känsligheten hos elektrokemiska sensorn analysen bestäms av signal-brusförhållandet. En mängd olika signalförstärkning och buller metoder minskning har utforskats. Vi finner att förbättra kemi sensorytan är nyckeln till att minska ospecifik bindning av detektorsonden och / eller HRP enzymet. I synnerhet, har en blandad monolager av alkanedithiols och mercaptohexanol befunnits reducera bakgrunden genom att täcka elektroden ytan mer fullständigt bibehållen tillgänglighet infångningsproben för mål hybridisering 3. Dessa ytkemi behandlingar är särskilt viktigt för analyser som inbegriper komplexa biologiska prover.
Den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här möjliggör snabb upptäckt av nukleinsyramål. Känslighet och specificitet beror delvis på den fria energin för mål-sondhybridisering, vilket i sin tur beror på längden och GC-halten av avskiljning och sonder detektor. Vi utför typiskt hybridiserings stegen vid omgivande temperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Däremot kan hybridisering stegen (3.2 och 3.3) även genomföras vid högre temperaturer i en hybridiseringsugn om chipset placeras i en täckt kammare …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av samarbetsavtal Award AI075565 (till DAH) från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar samt av Wendy och Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC är Judith och Robert Winston Stol i Pediatric Urology.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
Table 1. Reagents and Equipment. |