Summary
Fremgangsmåte for å observere individuelle DNA molekyler i levende celler er beskrevet. Teknikken er basert på bindingen av en fluorescensmerket tagget lac repressor protein til bindingsseter konstruert inn i DNA av interesse. Denne metoden kan være tilpasset for å følge mange rekombinante DNA'er i levende celler over tid.
Abstract
Få naturlig forekommende plasmider er opprettholdt i pattedyrceller. Blant disse er genomene av gamma-herpesvirus, inkludert Epstein-Barr virus (EBV) og Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV), som forårsaker flere menneskelige maligniteter 1-3. Disse to genomer er kopiert i en lisensiert måte, hver med en enkelt viral protein og mobil replikering maskiner, og sendes til datter celler ved celledeling til tross for sine mangler tradisjonelle sentromerer 4-8.
Mye arbeid har blitt gjort for å karakterisere replications av disse plasmid genomer bruker metoder som blotting og fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse metodene er begrenset, skjønt. Kvantitativ PCR og Sør blotter gi informasjon om gjennomsnittlig antall plasmider per celle i en populasjon av celler. Fisk er en encellet assay som avslører både gjennomsnittlig antall og fordelingen av plasmid s per celle i bestanden av celler, men er statisk, slik at ingen informasjon om foreldre eller avkom av den undersøkte cellen.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere plasmider i levende celler. Denne metoden er basert på bindingen av en fluorescensmerket tagget laktose repressor protein til flere steder i plasmidet av interesse 9. DNA av interesse er konstruert for å omfatte ca 250 tandem gjentar av laktose operatøren (Laco) sekvens. Laco spesifikt bundet av laktose repressor protein (laci), som kan være kondensert til en fluorescerende protein. Fusjonsproteinet kan enten uttrykt fra konstruerte plasmid eller introdusert av en retroviral vektor. På denne måten, er de DNA-molekyler fluorescensmerket tagget og derfor bli synlig via fluorescens mikroskopi. Fusjonsproteinet er blokkert fra å binde den plasmid-DNA ved å dyrke celler i nærvær av IPTG inntil plasmidene er klare for å bli sett.
ontent "> Dette systemet gjør plasmidene skal overvåkes i levende celler gjennom flere generasjoner, avslørende egenskaper deres syntese og partisjonering datter celler. Ideelle celler er tilhenger, lett transfektert, og har store kjerner. Denne teknikken har blitt brukt til å fastslå at 84% av EBV-avledet plasmider er syntetisert hver generasjon og 88% av den nylig syntetisert plasmider partisjon trofast til datter celler i HeLa celler. par av disse EBV plasmider ble sett å være bundet til eller assosiert med søsterkromatider etter deres syntese i S- fasen før de ble sett å skille som søsterkromatider separert i anaphase 10. Metoden blir nå brukt til å studere replikering av KSHV genomer i HeLa celler og SLK celler. HeLa celler udødeliggjort menneskelige epitelceller, og SLK celler foreviget human endotelial celler. Selv SLK celler ble opprinnelig stammer fra en KSHV lesjon, verken HeLa eller SLK cellelinje naturlig HarbORS KSHV genomer 11. I tillegg til å studere virusreplikasjon, kan denne visualiseringen teknikken brukes til å undersøke effektene av tilsetning, fjerning, eller mutasjon av ulike DNA sekvens elementer på syntese, lokalisering, og oppdeling av andre rekombinante plasmidkonstruksjoner DNA'er.Protocol
1. Prosjektering av celler med synlig Plasmids
- Bruk standard begrensning fordøyelsen eller homolog rekombinasjon teknikker for å innføre et DNA-fragment inneholdende ca 250 kopier av laktose operatøren sekvensen (Laco) i plasmidet å bli visualisert. Vår plasmid var en BACmid på ca 170 kbp og inneholdt hele genomet av Kaposis sarkom-assosiert herpes virus (KSHV) og kodede motstand mot hygromycin 12.
- Innføre Laco-holdige plasmid DNA inn pattedyrceller ved transfeksjon med Lipofectamine 2000. Vi transfektert HeLa og SLK celler i 60 mm skåler i 4 timer med 10 ug renset plasmid DNA med 25 pl 2000 Lipofectamine, 0,5 ml OptiMEM, og 3,5 ml DMEM.
- Endre dyrkingsmediumet til 5 ml DMEM med 10% fetalt bovint serum og inkuber celler for 48 hr.
- Plate cellene ved lav tetthet i store retter og kultur celler i medium inneholdende et antibiotikum utvalg for innførte plaSmid, vi valgte celler i DMEM med 10% føtalt bovint serum med 300 ug / ml hygromycin for 3 uker.
- Bruke deler av sterile, trypsin-gjennomvåt filter papir for å overføre hygromycin-resistente kolonier på nye kultur retter.
- Når transfekterte kloner har vokst til å fylle formen, isolere DNA for begrensning fordøyelse og Southern blotting for å sikre at polymeren av Laco plasmidet er homogen og av den forventede størrelse.
- Hvis plasmidet ikke er konstruert for å uttrykke en fusjon av Laci, infisere egnede kloner med et retrovirus som koder for laktose repressor (Laci) smeltet til en rød fluorescerende protein, slik som Laci-tdTomato. Vi bruker tdTomato heller enn proteiner som fluoresce nærmere grønt for å minimere photoxicity som ville oppstå fra flere eksponeringer over lange tider 13.
- Når laci fusjonsproteinet blir introdusert, cellene kultur i nærvær av 200 ug / ml isopropyl-BD-thiogalactoside (IPTG) til å sperre fusjonsproteiner fra bindingDNA.
- Kultur cellene i minst tre dager å tillate uttrykk for Laci-tdTomato protein.
- Screen kloner (ved å vaske bort IPTG og vise celler som beskrevet nedenfor) for de med optimale nivåer av Laci-tdTomato som avslører tydelige signaler med minimale bakgrunnsnivåer av ubundet fusjonsprotein.
2. Utvikling av Imaging System
Vår imaging system består av en Zeiss Axiovert 200M er utstyrt med en motorisert scene og Plan-Aochromat 63x/1.4 olje mål. Fluorescenseksitasjon lys gis ved "nøytral hvit" LED av en Colibri system. Utslipp er oppdaget av en CascadeII: 1024 EMCCD kamera. Dette er et avkjølt, back-tynnet kamera med en gevinst register for å forsterke signaler, den mørke strømmen er 0.061 elektroner per piksel per sekund, og Quantum effektiviteten er større enn 0,90. Systemet styres av Axiovision 4,8 programvaren, inkludert SmartExperiments modulen. For påvisning av tdTomatil vi bruke en Zeiss filtersettet 75HE hvor 85% av den passerte lys kan eksitere fluor og 95% av den utsendte lyset vil passere utslipp filteret.
- Montere en avbildning system med en omvendt mikroskop og en EMCCD kamera for påvisning av signaler, en LED lyskilde for spesifikke eksitasjon og rask forskaling, en motorisert scene og fokus arm og programvare kontroll for automatiserte oppkjøp av bilder over lengre tidsintervaller med flere z-stabler. Systemet skal sitte på en luft bordet for å bli isolert fra vibrasjoner.
- Montere en scene-top kuvøse å opprettholde celler ved 37 ° C, 5-10% CO 2 i en fuktet kammer. La det være tilstrekkelig tid for systemet til å komme til en stabil temperatur til redusere bevegelsene artefakter under eksperimentet.
- Bruk en oppvarmet krage for formålet å hindre målet fra tappe varme fra prøven.
3. Visualisering av merket DNA
- Plate celler i en 35 mmglass-bunn rett på en tetthet på mindre enn 10% konfluens, som vil tillate parene av celler til å dele inn kolonier av 8-16 celler uten overlappende. Gjør dette minst 24-48 time før avbildning, slik at de levedyktige cellene har tid til å dele.
- Én til tre time før starten av bildebehandling, skyll platen 3 ganger med kulturmediet som mangler både selektive medikamenter og IPTG. Denne prosedyren vasker bort ikke-levedyktige celler og lar Laci fusjonsproteiner å binde Laco områder i plasmider.
- Erstatt kulturmediet med 2 ml DMEM med 10% føtalt bovint serum og 25 mM HEPES.
- Erstatt toppen av kulturen tallerken med CultFoil strekkes i en monteringsring for en 35 mm tallerken. Dette dekselet vil hemme fordamping av kulturmedium, som ville øke saltkonsentrasjonen over tid og drepe cellene.
- Bruk differensial interferens kontrast (DIC) avbildning å vise cellene og bestem fokalplanet av toppen og bunnen av cellene i flere synsfelt.I hvert felt, flytte til en fokalplan omtrent 1/3 av veien ned fra toppen av cellen. Lagre x, y, z koordinatene i listen over lagrede scenen posisjoner.
Merk: Plasmid signaler kan ikke være synlig gjennom okularene når celler er opplyst av lysdioder av bølgelengden hensiktsmessig for laci fusjonsprotein. Svake signaler kan bare være synlig med bruk av EMCCD kamera, som tillater integrering av signalet over tid og dermed effektivt forsterker svake signaler. - I mikroskop kontroll programvare, definere en z-stack bilder som skal utføres på hvert lagret stadium posisjon. Velg az trinn størrelse på 0,35 til 0.50 mikrometer, som vil tillate deg å omtrentlige Nyquist sampling i z dimensjon 14. Inkludere "ekstra" skiver over og under flyene der cellene er plassert i, disse skivene tillate deteksjon etter celle bevegelser i løpet av cellesyklus, og brukes også i post-oppkjøpet behandling (dekonvolusjon) på bildet stabler. Dette inkluderingsdepartementet vilresultere i en stabel av 40-60 bilder, avhengig av tykkelsen av cellene.
- I mikroskopet kontrollprogramvare, definere en tidsserie eksperiment å samle et lyst felt bilde av z-stabler med 30 min intervaller (for sporing celledelinger og flyttinger over lange ganger) og fluorescens images at 10-60 min intervaller (for å visualisere plasmider i cellene). Ikke bruk DIC avbildning under eksperimentet, da det krever mer lys enn standard mørkefelt avbildning, som kan utsette cellene unødvendig å fototoksisitet løpet av lange eksperimenter.
- Start programvaren-kontrollert eksperiment. Sikre at systemet ikke blir forstyrret (bumped, utsatt for ekstrem lys, etc.) under forsøket.
- Om nødvendig, etterfylle vann i befuktning systemet under eksperimentet.
4. Etter oppkjøpet behandling av bilder
- Gjennomgå bildene for hver z-stack og tidspunkt. Beskjære ut noen unødvendige områderbildene til redusere datamaskinens behandlingstiden i neste trinn.
- Bruk en dekonvolusjon algoritme for å re-tildele signal intensitet til piksel opprinnelse i hvert z-stack 15. Selv om dette dekonvolusjon kan være basert på et teoretisk synspunkt spredning funksjonen for imaging system, er det best å måle det punktet spredt funksjonen ditt system av tenkelig fluorescerende mikrosfærer, og bruke denne målingen i dekonvolusjon algoritmen. Vi målte punktet spredt funksjonen av vårt imaging system og anvendt en begrenset iterativ maksimal sannsynlighet algoritme i AxioVision programvare (AxioVision programvare beskrivelse, Zeiss).
- Undersøke bildene for å spore intensiteten endringer og bevegelser plasmider under cellesyklus og partisjonering av plasmider til datteren celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Maksimal intensitet projeksjoner av Z-stabler ervervet i et representativt eksperiment er vist i figur 3.. Typiske plasmid signaler er tilstede i 3-8 stykker av z-stakken, avhengig av om de representerer én eller klynger av plasmider. I tilfelle av EBV-og KSHV-avledede plasmider, signalene beveger seg sakte i cellen til cellen når mitose. Cellene selv vandrer i løpet av eksperimentet. De også blitt sfærisk og løsner fra rett under mitose. Cellesyklus for friske HeLa og SLK celler tar ca 24 timer, celler av disse typene som tar mer enn 30 timer å fullføre cellesyklus bør vurderes usunn. Datterceller typisk feste i nærheten av hverandre og går på å dele på samme tid i den neste cellen syklus. Kun celler som kan bli vist å fullføre en cellecyklus bør analyseres.
05/4305fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Scheme for å gjøre plasmider synlig. (A) Tandem gjentar av laktose operatøren sekvensen (Laco) blir klonet inn i plasmidet av interesse. Laktose repressor protein (laci) binder seg spesifikt til disse sekvenser; smelting til en fluorescerende protein rekrutterer fluoriserende tag til plasmidet av interesse. (B og C) Kjernen i en HeLa celle uttrykker laci-tdTomato er fluorescerende grunnet kjernefysiske lokalisering signalet på fusjonsproteinet lokalisere den til kjernen. KSHV genomer koder Laco sekvenser rekruttere mange kopier av den fluorescerende protein og skiller seg ut som lyse signaler over bakgrunnen intensiteten av kjernen i fravær av IPTG (B), mens de laci-fluorescerende proteiner er forhindret til å binde til sin anerkjennelse Laco sekvens tilstedeværelsen av IPTG (C). Disse bildene er laget beregningsmessig å inkludere flere z-plan der de ulike signalene bor.
Figur 2. Diagram av plasmidet visualisering prosedyren. Først, er tandem Laco gjentar klonet inn i plasmidet av interesse. At plasmid innføres i celler ved transfeksjon. Kloner av transfekterte celler velges og screenet, og deretter infisert med et retrovirus uttrykker en fluorescerende laci fusjonsprotein.
Figur 3. Omtale bilder å spore plasmider hele cellesyklus. Fluorescensmerket kodede virale genomer i en HeLa celle (A) er syntetisert i S-fase (B) og partisjonert til datterceller ved celledeling (CE), og kan bli fulgt for flere generasjoner. Vist er maksimal intensitet prognoser for z-stabler ervervet av en HeLa cellesyklus på fem tidspunkter i et representativt eksperiment. Disse bildene er laget som i figur 1B og C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som er beskrevet her kan brukes til å følge plasmider i levende pattedyrceller over tid som spenner over flere generasjoner. Ved å begrense eksponering for eksitasjon lys, har vi brukt disse teknikkene til å følge celler fra nylig delt par gjennom kolonier av 16-32 celler, som representerer minst 72 timer og 3 celledelinger. Disse eksperimentene gi informasjon som ikke kan skaffes fra statiske analyser som kvantitativ PCR, Southern blotting og fisk.
Det er viktig å skjerme kloner av celler for plasmider med en homogen struktur, som rearrangements kan oppstå ved bruk av plasmider med repetitive sekvenser som for eksempel tandem Laco gjentas. I tillegg, er det nyttig å optimalisere retrovirus infeksjon og skjermen kloner av infiserte celler for en optimal signalintensiteten. Celler som uttrykker for mye laci protein vil ha høy bakgrunnsfluorescens i kjernen, og de uttrykker for lite vil ha svake signaler. Til slutt, jeg deter viktig å se på celle morfologi og velge sunne celler ved merking synsfelt å bruke under visualisering deres.
Denne teknikken kan brukes til å visualisere nesten enhver DNA molekyl, forutsatt at det kan være konstruert for å inkludere tandem gjentar av Laco sekvensen. Eksempler inkluderer mobilnettet kromosomer, naturlig forekommende og kunstig plasmider, og virale genomer pakket i virioner. I forsøk som ligner det som er avbildet i figur 3, fant vi at våre KSHV-deriverte plasmider synes å være partisjonert tilfeldig under celledeling. En logisk utvidelse av teknikken er å merke en DNA-molekylet som en Laco / laci paret med en fluorescerende protein, og en annen DNA-molekylet i den samme celle som et Tetracycline Operatør / Tetetracycline Repressor par med en annen fluorescerende protein. Eksperimenter er begrenset av mengden av eksitasjon lys cellene tåler før opplever cytotoksiske effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra NIH og ACS, inkludert T32CA009135, CA133027, CA070723, og CA022443. Bill Sugden er en American Cancer Society forsker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
