Summary
Метод, описанный выделение и характеристика человека пульпы зуба стволовые клетки (hDPSCs), используя либо
Abstract
Introduction
Стволовые клетки являются клоны клеток, которые обладают двумя замечательными особенностями, известный как мульти-потенцию и самообновления 15. Среди всех стволовых клеток с разными потенциями репликативной, стоматологические стволовые клетки, как послеродовая стволовых клеток обратили внимание в последние годы из-за их доступности, пластичности и высокой пролиферативной способностью по сравнению с другими взрослыми стволовыми клетками 16. Характерно, похожие на мезенхимальные стволовые клетки, зубных стволовых клеток пульпы прилипшие клетки клоны, которые имеют несколько потенциал дифференциации в мезенхимы и / или не мезенхимы линий, как в пробирке и в естественных условиях. 1-8,17,18 DPSCs идентифицируются их негативное выражение гемопоэтических антигены (например, CD45, CD34, CD14), и положительное выражение CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 и STRO-1. 19,20
Легко получить потенциал с минимальным боли и заболеваемости сделать человека DPSCs как ценныйсостоянии источника МСК по сравнению с обычными источниками, такими как костного мозга мезенхимальные стволовые клетки 21. В общем, DPSCs были выделены либо результатом метода, т. е. миграции стволовых клеток из ткани пульпы эксплантов (DPSC-OG) 22-24, и / или путем ферментативного расщепления (DPSC-ED), 4,6,25. Предыдущие исследования показали, что метод выделения и условия культивирования могут вызывать различные группы населения или линий в пробирке под проходы 26,27. В случае постоянных зубов (pDPSCs), Хуанг и др. показали, что ферментативные переваривается pDPSCs имеют более высокий потенциал пролиферации по сравнению с переросла DPSCs 26. Кроме того, в случае молочных зубов (dDPSCs), было показано, что STRO-1 и CD34 Маркеры выразили более dDPSC-ED по сравнению с dDPSC-OG. Кроме того, dDPSC-ED отображаются выше скорость минерализации в определенных костно / odonto среде 27. Таким образом, благодаря выдающимся потенциалом DPSCs в гegenerative медицины, дополнительные исследования будут необходимы для лучшего понимания возможных различных групп населения, которые получены из различных методов изоляции.
Вот, это была попытка ввести простой способ извлечения целлюлозы, используя один шаг стоматологического алмазного диска для облегчения процесса извлечения целлюлозы. Кроме того, после выделения человека целлюлозно-производные стволовых клеток с применением ЭД или OG методы, общие свойства и способность дифференциации между двумя группами были также исследованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка раствора фермента и распространения среднего (PM)
- Сделать коллагеназы типа I Решение: Взвесить коллагеназы типа I (12 мг / мл) и растворяют в 1 мл PBS и фильтр с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Затем поместите его 15 мл трубки и хранить его при температуре от -20 ° C до необходимости.
- Сделать диспазы Решение: Взвесить диспазы (16 мг / мл) и растворяют в 1 мл PBS и фильтр с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Затем поместите его 15 мл трубки и хранить его при температуре 4 ° C до необходимости.
- Сделайте раствор фермента: Добавить 1 мл коллагеназы типа I решения (12 мг / мл) и 1 мл диспазы решения (16 мг / мл) в 2 мл стерильной PBS, содержащего 100 мг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина. Общая концентрация диспазы и коллагеназы я в конечном объеме должна составлять 4 мг / мл, 3 мг / мл, в слух. Затем аликвоты этого объема на четыре 15 мл трубки, каждая из которых содержит 1 мл раствора фермента. Каждая трубка может быть использована для одного целлюлозно пищеварения.
- Сделать моющего раствора: Добавить 100 мг / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина в PBS.
- Сделать основные средства массовой информации: Alpha изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина.
- Сделать распространения массовой информации (PM): Альфа изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицин, 0,25 мг / мл амфотерицина B.
- Сделать одонтогенных СМИ: Alpha изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 0,01 мкМ Дексаметазон, 5 мМ β-глицерин фосфат, 1,8 мМ монокалийфосфата.
2. Подготовить человека зубной ткани Целлюлоза для стоматологических Isolatio стволовых клеток Pulpп
- Нормальный человек третьих моляров были собраны из взрослых (21-29 лет) в стоматологической клинике имама Али в рамках утвержденных совет организации (IRB).
- Зубы были помещены в щелочной среде (α-MEM с добавлением 10% FBS) и были переданы в лабораторию при 4 ° C.
- В стерильных условиях, работая в рамках биологической ламинаре, настройка была сделана один 100 мм чашки Петри для каждого зуба для обработки. Поверхности зубов были убраны на 70% этанола.
- Во время работы в одном из чашках Петри, зуб был сохранен стоматологические щипцы и скальпель был использован для очистки от мусора и периодонтальной связки на корнях.
- Cemento-эмаль перехода медленно вырезать с помощью стерилизованные стоматологические диски, чтобы показать пульпы. Следует учитывать, что процесс резки должны быть выполнены медленно, чтобы уменьшить перегрев ткани зуба.
- Целлюлозно ткань мягко отделены от коронки и корня. Целлюлозно ткань была разрезана на маленькие кусочки с помощью скальпеля.
3. Изоляция человека Стоматологическая Целлюлозно
- Целлюлозно ткани прошли либо ферментативного распада ткани пульпы или прямым следствием клетки из ткани пульпы эксплантов для изоляции hDPSCs.
- Ферментативной диссоциации ткани пульпы:
- Небольшие кусочки ткани пульпы были переведены в раствор фермента в течение 1 часа при 37 ° C. Vortex каждые 30 мин, чтобы помочь разрушение тканей.
- После этого, крупные агрегаты клетки были удалены, и Single-клеточной суспензии были получены путем пропускания клеток через 70-мкм ячейки фильтра.
- Single-клеточной суспензии центрифугировали при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Супернатанты осторожно пипеткой, а осадок повторно суспендируют в 1 мл распространения среды (PM). (Примечание: FBS в среде распространения прекратить ферментативных расдиссоциация).
- Single-клеточной суспензии пульпы зуба был посеян на 25 см 2 колбы с культурой сообщения, а затем инкубировали при 37 ° С в 5% СО 2.
- Культуральную среду меняли каждые три дня, пока клетки слияния было достигнуто.
- Прямой результат ячейки из эксплантов тканей пульпы:
- Целлюлозно ткань фарш в 1-2-мм фрагменты, и каждый кусок был помещен в 25-см 2 колбы с культурой с вечера, а затем инкубировали при 37 ° С в 5% СО 2. Следует учитывать, что общий объем PM для вырост клеточной должны поддерживать присоединение целлюлозно пьесы для дальнейшего вырост клетки (2-3 мл на флакон).
- Средний был изменен после выроста наблюдается.
- Переросли клетки при слиянии были суб-культурных при соотношении 1:4 (отрывок 1).
4. Иммунофенотипирование
- 250000 клеток /трубки обоих типов клеток в проход 3, насиживают PE или FITC-сопряженных анти-антител человека с их изотипов в течение 30 мин при 4 ° С в темном месте. (Примечание:. Концентрации антител был применен в соответствии с протоколом производстве)
- После инкубационного периода, 100 мкл PBS или FACS разбавления раствора добавляли в каждую пробирку и центрифугируют при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин в темном месте.
- Супернатанты были удалены и гранулы ресуспендировали в 100 мкл PBS или FACS разведения в темном месте.
- Целевые поверхностных маркеров (CD маркеров) были оценены BD FACSCalibur.
5. Индукции дифференцировки из DPSCs в минерализованных клетки и количественные анализа ализарин красный S
- DPSCs, которые были получены либо ферментативного распада ткани пульпы (известный как DPSC-ED), или прямым следствием клетки из ткани пульпы эксплантов (DPSC-OG) были суб-культивировали в течение 3 проходов.
- т Прохождение 3, клетки семя в 6-луночный планшет при 5000 клеток / лунку.
- При слиянии 60%, средний одонтогенных были заменены на обычные сообщения. Три скважины остались в качестве отрицательного контроля путем добавления питательной среды.
- Средний меняться каждые 3 дня до 21-й день.
- На 21 день, Клетки промывали PBS и фиксировали на 1 мл / лунку 10% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Тогда параформальдегида пипеткой, тщательно и клетки промывали 3 раза (5-10 мин каждый раз) с дистиллированной H 2 O. (Примечание: Не нарушая монослоя.)
- После промывания 1 мл / лунку ализарин красные S были добавлены в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Клетки промывали деионизированной H 2 O в четыре раза (5 мин для каждого времени с нежным качалки), чтобы удалить любые дополнительные красные ализарин.
- 1 мл / и H 2 O были добавлены, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
- Планшеты Предполагается, что визуальные модулиpection и / или захвата изображений.
- Для количественного анализа ализарин красный S, H 2 O были заменены на 1 мл 10% уксусной кислоты в каждую лунку 6-луночный планшет и инкубировать 30 минут при комнатной температуре при встряхивании.
- Тогда, клеточный монослой / а были царапины и как уксусная кислота и клетки были перенесены в отдельное 1,5 мл микро-пробирок. (Примечание:. Каждую лунку должно быть передача в отдельную трубу т.е. три пробных скважин и бурение трех скважин управления для каждого ED & OG группы)
- Пробирки встряхивали энергично в течение 30 сек.
- Нагреть до 85 ° C в течение 10 мин. (Примечание: во избежание испарения, трубы были запечатаны с парафином).
- После отопления, трубы были переданы в лед на 5 мин. (Примечание: трубы не должна быть открыта, пока стали охлаждаться.)
- Суспензии центрифугировали при 20000 х г в течение 15 мин. В то время как центрифугирование, ализарин красный стандарты были сделанывверх.
Стандартные ализарин красный S были получены сначала разбавления буфером для разведения и используется для изготовления 2-кратные серийные разведения на основе таблицы.
| Высокая концентрация диапазон красителей | Низкая концентрация диапазон красителей | ||||||||||||
| 2 мМ | 1 мМ | 500 мкМ | 250 мкМ | 125 мкМ | 62,5 мкм | 31,3 мкм | 15,6 мкм | 7,8 мкм | 3,9 мкм | 1,9 мкМ | 0,9 мкм | 0,4 мкМ | Пустой |
- После центрифугирования 1 мл супернатанта / трубки были перенесены в новую отдельную 1,5 мл микро-пробирок.
- РН нейтрализовали ~ 375 мкл 10% Гидроксида аммония в трубке. (Примечание: рН ярость должна быть 4.1-4.5).
- 150 мкл стандартных образцов и (включает в себя отдельные испытания и контроль) были добавлены в непрозрачной стенкой, прозрачным дном 96-луночный планшет.
- Оптическую плотность при 405 нм и OD значения из образцов по сравнению со стандартными участок для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- DPSCs которые были получены путем ферментативного диссоциации (DPSC-ED) показаны здесь в 10 день, 15,18 (рис. 1). Колонии с инициативой сформировать почти на 3 до 5 дней после изоляции.
- Переросли DPSCs (DPSC-OG) показаны на рисунке 2 по 5 дней, 10, 13 и 18. Фибробластоподобные клетки начали мигрировать из ткани пульпы в колбу параллельных заказов почти на 5 дней после посева.
- DPSCs при прохождении 3 с использованием обоих методов показаны на рисунке 3. Оба типа DPSCs были почти такого же размера и морфологии.
- Иммунофенотипирование результатов в DPSC-ED и DPSC-OG (рис. 4). Эти результаты указывают на наличие маркеров мезенхимальных стволовых клеток, таких как CD44, CD73, CD105 и CD90, и отсутствие гемопоэтических и эндотелиальных маркеров, таких как CD34, CD45 и CD11b . Выражений CD105 и CD146 (периваскулярные маркер) были больше в DPSC-OG по сравнению с DPSC-ED.STRO-1 был отрицательным в обеих группах. (Синяя линии, упомянутые О.Г. группы, в то время как красные линии, упомянутые ED один, желтыми линиями указано изотипов).
- Морфология ализарин красный S & количественной оценки результатов минерализованных формирования тканей в DPSC-ED и DPSC-OG на 21 день показано на рисунке 5. Чем больше поглощать красный цвет более отложение кальция. Эти результаты указывают на более отложение кальция в дифференцированных DPSC-ED (D) по сравнению с DPSC-OG (с). (Triplicate технических репликаций) количественная ализарин красный S также указал на значительный (*) высокой концентрации красителя между DPSC-ED по сравнению с группами OG. (Концентрации красителя также значительно увеличился (**, ***) между тестами и контроля каждой группы (ED или OG), которые указывают на отложение кальция после процесса дифференцировки)
(Примечание: парный Т-тест анализ был использован для определения различий вколичество минерализованной матрицы производится ED и О. Г. группы после индукции дифференцировки. Результаты выражали как среднее ± SEM. (Значимость принятых для Р <0,05)
- QPCR результаты выражении одонтобласт и минерализованных связанных генов (DSPP) и (Мепе, ALP), соответственно, в дифференцированных DPSC-ED & DPSC-OG показано на рисунке 6. Эти результаты указывают на значительную до-регулирование ALP и Мепе После дифференциации ED и О. групп. Между тем, ALP и Царицы выражения были значительно выше в дифференцированных DPSC-ED по сравнению с дифференцированными DPSC-OG. Тем не менее, нет никакой разницы в выражении DSPP в дифференцированных клетках между двумя группами (домашнее хозяйство гена: Тирозин 3-monooxygenase/tryptophan 5-монооксигеназной активации белка (YWHAZ)) 28.
(Примечание:. QPCR данные были проанализированы с использованием сравнительного метода КТ годовых МРЭО Т-тест анализа была использована для определения различия в экспрессии генов между ED & OG групп до и после дифференциации, а также между дифференцированных клеток из двух групп. Результаты выражали как среднее ± SEM. (Значение принятых для Р <0,05) (Triplicate технических репликаций)
Рисунок 1. Ферментативный диссоциированных DPSC (DPSC-ED) на 10 дней, 15 и 18. Увеличение бар = 200 мкм.
Рисунок 2. Переросли DPSCs (DPSC-OG) на 5 дней, 10, 13 и 18. Увеличение бар = 200 мкм.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Переросли DPSCs (DPSC-OG) и ферментативная переваривается DPSCs (DPSC-ED), морфология в проходе 3. Увеличение бар = 200 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Наложение Гистограмма иммунофенотипирования результатов в DPSC-ED (темно-красный) и DPSC-OG (Blue). (Желтые линии представляют изотипов). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
hres.jpg "/>
Рисунок 5. Ализарин красный S окрашивания результатов в дифференцированных DPSC-OG (с), и дифференцированные DPSC-ED (D). (А) и (б) сослался на контроль. Количественный анализ ализарин красный S показать еще поглощения красителя в дифференцированных DPSC-ED по сравнению с дифференцированными О.Г. группы (е). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. QPCR результаты выражении одонтобласт и минерализованных связанных генов (DSPP) и (Мепе, ALP), соответственно, в дифференцированных DPSC-ED & DPSC-OG. Выражение Мепе, ALP, и DSPP в дифференцированных клетках по сравнению с контролем подтвердили дифференциация обеих групп в одонтобласт (переменного тока). Эти гesults указано значительные до-регулирование ALP и Царицы после дифференциации ED и О. групп (и б). Между тем, ALP и Царицы выражения были значительно выше в дифференцированных DPSC-ED по сравнению с дифференцированными DPSC-OG (и б). Тем не менее, нет никакой разницы в выражении DSPP в дифференцированных клетках обеих группах (с) (домашнее хозяйство гена: Тирозин 3-monooxygenase/tryptophan 5-монооксигеназной активации белка; YWHAZ). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает процесс выделение и характеристика hDPSCs из пульпы зуба с помощью двух методов, ферментативной диссоциации и прямым следствием стволовых клеток из эксплантов тканей пульпы. Кроме того, в пробирке дифференциации этих клеток в одонтобластов, оценивали с помощью анализа количественных ализарин красный S & QPCR.
Существующие протоколы для выделения ткани пульпы зуба от человека были использованы различные инструменты, такие как щипцы (щипцы кости) 9, экстирпация иглы 29, кюретки Грейси 30, стоматологических боров трещина 4, и т.д. Эти методы занимают много времени, а учитывая низкий уровень перегрева пульпы путем добавления воды непрерывно. Тем не менее, в текущем техника, стоматологическое алмазным диском используется для выделения ткани пульпы, которая является быстрым способом сократить зуба с минимальным загрязнением в один этап, и сводит к минимуму перегрева пульпы во время процесса резки. Кроме того, hDPSCsповторно, наконец дифференцированы в одонтобластов, которые никогда не сравнивал в случае человека постоянных зубов обсуждались цели. Сравнительная оценка дифференцированного hDPSCs (ED & OG группы) с помощью анализа количественных ализарин красный S указано выше минерализация потенциал hDPSC-ED по сравнению с OG группы. Эти результаты также подтверждают QPCR. DSPP, ALP и Царицы, как минерализация маркеры регулируются вверх после одонтобласт дифференциации в обеих группах. С другой стороны, выражения Мепе и ALP были выше в дифференцированных hDPSC-ED по сравнению с контролем. В соответствии с предыдущим исследованием о молочных зубах 27, стволовые клетки, полученные из постоянных зубов с помощью ED или методов О. изоляции также имеют схожие поведения дифференциации на тех же условиях. Кроме того, для лучшего сравнительной оценке, в этом исследовании, как hDPSC-ED & hDPSC-OG были изолированы от тех же лиц.
Выражения MSC маркерыг отсутствии heamatopietic / эндотелиальные маркеры выявления обоих типов hDPSCs как мезенхимальные стволовые клетки. С другой стороны, CD 105 / CD 146 были выше в DPSC-OG по сравнению с ED групп. Несмотря на имеющиеся доказательства по наличию STRO-1 в DPSCs 31, наши результаты не показали выражение STRO-1 в обеих группах. Тем не менее, значительное разнообразие в поверхностных маркеров экспрессии в различных исследованиях может быть обусловлено либо условий культивирования, такие как прохождение количество, состав среды и т.д., или межличностные различия между различными донорами. Отсутствие STRO-1 в обеих группах может свидетельствовать о том, что экспрессия этого маркера не может непосредственно влиять на потенциальную одонтобласт дифференциации (не показано на видео).
Различные изоляции hDPSCs состояние может привести различной мощности дифференциации. Эти различия могут быть связаны с существованием различных групп населения в ткани пульпы. Таким образом, выбор методов МиГ изоляцииHT быть полезной для целевой ткани конкретного ремонта и восстановления для будущих клинических подходов. Наши результаты свидетельствуют о более высокой минерализации мощности ферментативных переваривается DPSC по сравнению с переросла из них. Однако дополнительные исследования, такие, как оценка формирования трубчатой структуры в естественных условиях и в пробирке, необходимо определить, какой из этих двух процедур применяется для функциональной дентина / целлюлозы терапии регенерации тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы выражаем глубокую признательность д-р Лейла Shakeri и доктор Ареф Dournaei для их критического обсуждения и г-н Мохаммад Реза Хадем Шариф для его технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
