Summary
Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder
Abstract
Introduction
Stammzellen sind Zellen, die klonogenen zwei bemerkenswerte Features, wie Multi-Potenz und Selbst-Erneuerung 15 bekannt zu besitzen. Unter allen Stammzellen mit verschiedenen Potenzen replikativen haben dentalen Stammzellen als die postnatale Stammzellen Aufmerksamkeit in den letzten Jahren ziehen wegen ihrer Zugänglichkeit, Plastizität und hohe proliferative Fähigkeit im Vergleich zu anderen adulten Stammzellen 16. Charakteristischerweise ähnlich zu den mesenchymalen Stammzellen sind Zahnpulpa Stammzellen adhärenten Zellen, die mehrfache klonogenen Differenzierungskapazität in Mesenchym und / oder nicht-Mesenchym Abstammungslinien, sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen. 1-8,17,18 DPSCs werden identifiziert durch ihre negative Ausdruck von hämatopoetischen Antigene (zB CD45, CD34, CD14) und positive Expression CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 und STRO-1. 19,20
Leicht erhalten Potenzial mit minimalen Schmerzen und Morbidität zu menschlichen DPSCs als wertvolleLage Quelle von MSCs zu den gewöhnlichen Quellen, wie Knochenmark mesenchymale Stammzellen 21 verglichen. Im Allgemeinen haben sich entweder durch Auswachsen DPSCs Verfahren, dh Migration von Stammzellen aus Zellstoff Gewebeexplantate (DPSC-OG) 22-24, und / oder durch enzymatischen Verdau (DPSC-ED) 4,6,25 isoliert worden. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Isolierungsmethode und Kulturbedingungen können verschiedene Populationen oder Linien unter in vitro Durchlässe 26,27 induzieren. Im Fall der zweiten Zähne (pDPSCs), Huang et al offenbart, dass die enzymatische verdaut pDPSCs höheren Proliferationspotential haben im Vergleich zu den herausgewachsen DPSCs. 26 zudem im Falle von Milchzähnen (dDPSCs), es wurde nachgewiesen, dass STRO-1 & CD34 Marker Ausdruck mehr in dDPSC-ED im Vergleich mit dDPSC-OG. Darüber hinaus erscheint dDPSC-ED höheren Mineralisierungsgeschwindigkeit in definierten osteo / odonto Medium. 27 Daher ist aufgrund der hervorragenden Potenzial DPSCs in regenerative Medizin, werden weitere Studien zum besseren Verständnis der möglichen verschiedenen Populationen, die aus verschiedenen Isolierungsverfahren abgeleitet sind erforderlich.
Hier war es Versuch einfache Art Pulpenextraktion einzuführen, indem in einem Schritt dentalen Diamantscheibe um den Prozess der Pulpenextraktion erleichtern. Darüber hinaus wurde nach der Isolierung von menschlichen Zellstoff-Stammzellen durch Anlegen ED oder OG Methoden wurden allgemeinen Eigenschaften & Differenzierungskapazität zwischen zwei Gruppen ebenfalls untersucht.
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Protocol
Ein. Bereiten Sie die Enzymlösung und Proliferation Medium (PM)
- Make Collagenase Typ I Lösung: Einwaage Collagenase Typ I (12 mg / ml) und lösen sich in 1 ml PBS und Filter unter Verwendung einer Spritze 0,2 um Filter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei -20 ° C bis benötigt.
- Machen Dispase Lösung: abwiegen Dispase (16 mg / ml) auflösen und in 1 ml PBS und Filter mit einer 0,2 um Spritzenfilter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei 4 ° C bis benötigt.
- Make Enzymlösung: 1 ml Kollagenase Typ I-Lösungen (12 mg / ml) und 1 ml Dispase Lösungen (16 mg / ml) in das 2 ml sterilem PBS, die 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin. Volle Konzentration von Dispase und Collagenase I in Endvolumen sollte 4 mg / ml und 3 mg / ml, rezeptiv sein. Dann Aliquot dieses Volumen um vier 15-ml-Tube, die jeweils 1 ml Enzymlösung. Jedes Rohr könnte ein Zellstoffkochung verwendet werden.
- Machen Waschlösung: In 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin in PBS.
- Machen basischen Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS und 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin ergänzt.
- Machen Sie das Proliferation Media (PM): Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml ergänzt Streptomycin, 0,25 mg / ml Amphotericin B.
- Machen Odontogene Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 0,01 uM ergänzt Dexamethason, 5 mM β-Glycerin-Phosphat, 1,8 mM Monokaliumphosphat.
2. Bereiten Menschliche Dental Pulp Tissue for Dental Pulp Stem Cell Isolation
- Normale menschliche dritte Molaren wurden von Erwachsenen (21-29 Jahre) an der Zahnklinik des Imam Ali im Rahmen genehmigter Institutional Review Board (IRB) gesammelt.
- Zähne wurden in das basische Medium (α-MEM mit 10% FBS ergänzt) platziert und wurden in Labor bei 4 ° C transferiert
- Unter dem sterilen Bedingungen, die innerhalb einer biohazard Laminarströmungshaube, Set-up wurde ein 100 mm Petrischalen für jeden Zahn verarbeitet werden getan. Zahnoberflächen wurden durch 70% Ethanol gereinigt.
- Während der Arbeit in einer der Petrischalen wurde Zahn durch Zahnzange gehalten und mit einer Skalpellklinge wurde verwendet, um sauber aus Debris und Parodontalspalt an den Wurzeln.
- Schmelzzementgrenze wurde langsam durch sterilisiert zahnärztliche Disc, um die Pulpakammer sichtbar zu machen. Es sollte berücksichtigt werden, dass Schneidvorgang langsam durchgeführt werden muß, um eine Überhitzung des reduzieren Zahngewebe werden.
- Pulpagewebe wurde vorsichtig von der Krone und Wurzel getrennt. Pulpagewebe wurde in kleine Stücke mit Hilfe einer Skalpellklinge geschnitten.
3. Menschliche Dental Pulp Isolation
- Pulp Geweben unterzog entweder enzymatische Spaltung von Pulpagewebe oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate für die Isolierung von hDPSCs.
- Enzymatische Dissoziation von Pulpagewebe:
- Kleine Stücke von Zellstoff Gewebe wurden in Enzym-Lösung für 1 Std. bei 37 ° C überführt Vortex alle 30 min zu helfen Aufbrechen Gewebe.
- Danach wurden große Zellaggregate entfernt und Einzel-Zellsuspensionen wurden erhalten, indem man Zellen durch eine 70-uM Zellsieb.
- Einzelzell-Suspensionen wurden bei 1200 UpM für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Überstände wurden vorsichtig abpipettiert und Pellet wurde in 1 ml Proliferationsmedium (PM) resuspendiert. (Hinweis: FBS in Proliferationsmedium beenden enzymatische dissenschaften.)
- Einzelzell-Suspensionen von Zahnpulpa wurde in 25 cm 2 Kulturkolben mit PM ausgesät und anschließend bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Das Kulturmedium wurde alle drei Tage gewechselt, bis die Zelle Konfluenz erreicht war.
- Direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate:
- Pulp Gewebe wurde in 1-2-mm-Fragmente zerkleinert, und jedes Stück wurde in 25-cm 2 Kulturflaschen mit PM platziert und dann bei 37 ° C in 5% CO 2. Es sollte berücksichtigt werden, dass Gesamtvolumen des PM nach Auswuchs der Zelle muss die Befestigung der Pulpe Stücke für weitere Zelle Auswuchs (2-3 ml pro Flasche) unterstützt werden.
- Medium wurde nach Auswuchs beobachtet.
- Die entwachsen Zellen bei Konfluenz wurden subkultiviert in einem Verhältnis von 1:4 (Durchgang 1).
4. Immunphänotypisierung
- 250.000 Zellen /Rohr von beiden Arten von Zellen in Passage 3 wurden durch PE oder FITC-konjugiertem Anti-Human-Antikörpern mit deren Isotypen für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert. (Anmerkung:. Die Konzentration von Antikörpern, wurde gemäß der Herstellung Protokoll angewendet wird)
- Nach der Inkubationszeit wurden 100 ul PBS oder FACS Verdünnungslösung zu jedem Röhrchen zugegeben und zentrifugiert bei 1.200 rpm für 5 min in dunklen Ort.
- Überstände wurden entfernt und Pellets wurden in 100 ul PBS oder FACS-Verdünnung in dunklen Ort resuspendiert.
- Gezielte Oberflächenmarker (CD-Marker) wurden von BD FACSCalibur ausgewertet.
5. Induktion der Differenzierung von DPSCs in mineralisierten Cells & Quantifizierte Alizarin Red S Assay
- DPSCs, die entweder durch enzymatische Spaltung von Pulpagewebe (bekannt als DPSC-ED) oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG) erhalten wurden, waren subkultiviert für 3 Gänge.
- At Passage 3 wurden die Zellen in einer 6-Well-Platte bei 5.000 Zellen / well Samen.
- Bei Konfluenz von 60% wurden odontogenen Medium durch herkömmliche PM ersetzt. Drei Vertiefungen wurden als negative Kontrolle durch Zugabe Wachstumsmedium blieb.
- Medium alle 3 Tage bis Tag 21.
- Am Tag 21 wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wurden durch 1 ml / Vertiefung 10% Paraformaldehyd für 15 Min. bei Raumtemperatur fixiert.
- Dann Paraformaldehyd wurde, sorgfältig und pipettiert Zellen wurden 3 mal (5-10 min für jedes Mal) mit destilliertem H 2 O gewaschen (Hinweis: Vermeiden Sie stören die Monoschicht.)
- Nach dem Waschen wurden 1 ml / Vertiefung Alizarinrot S für 20 min bei Raumtemperatur zugegeben.
- Zellen wurden durch deionisiertes H 2 O viermal (5 min für jede Zeit auf dem Schüttler) gewaschen, um alles zusätzliche Alizarinrot entfernen.
- 1 ml / Vertiefung H 2 O zugegeben, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Die Platten wurden auf visuelle ins angenommenpection und / oder Bildaufnahme.
- Für Alizarin Red S Quantifizierung Assay wurden H 2 O durch 1 ml 10% ige Essigsäure zu jedem Well der 6-Well-Platte und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln ersetzt.
- Dann wurden Zellmonoschicht / Vertiefung schaben & sowohl Essigsäure und Zellen wurden in die getrennten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. (Hinweis:. Jede Vertiefung sollte Transfer sein in ein separates Röhrchen dh drei Probebohrungen & drei Kontrollvertiefungen für jede ED & OG Gruppen)
- Die Röhrchen wurden 30 Sekunden lang kräftig verwirbelt.
- Erhitzen auf 85 ° C für 10 min. (Hinweis: die Verdunstung zu vermeiden, wurden Röhrchen mit Parafilm versiegelt.)
- Nach dem Erhitzen wurden Rohre in Eis für 5 min übertragen. (Hinweis: Rohre sollten nicht geöffnet werden, wenn sich gekühlt werden.)
- Die Aufschlämmungen wurden bei 20.000 × g für 15 min zentrifugiert. Während Zentrifugieren wurden Alizarin Red Normenbis.
Alizarin Red S-Standard wurden zuerst durch Verdünnen der Verdünnungspuffer & verwendet für die Herstellung 2-fach serielle Verdünnungen auf der Basis der Tabelle vorbereitet.
| High Range Konzentration des Farbstoffs | Low Range Konzentration des Farbstoffs | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 uM | 250 uM | 125 uM | 62,5 uM | 31,3 uM | 15,6 uM | 7,8 uM | 3,9 uM | 1,9 uM | 0,9 uM | 0,4 uM | Leer |
- Nach der Zentrifugation wurden 1 ml Überstand / Rohr in neuen, separaten 1,5 ml Mikro-Zentrifugenröhrchen überführt.
- Der pH wurde mit ~ 375 ul 10 neutralisierten% Ammoniumhydroxid pro Röhrchen. (Anmerkung: der pH Wut sollte 4,1-4,5 sein.)
- 150 ul von Standard & Proben (umfasst separate Tests & Kontrollen) wurden in einem undurchsichtigen Wänden, transparenter Boden 96-well-Platte gegeben.
- Die Absorption wurde bei 405 nm abgelesen und OD-Werte aus den Proben wurden mit Standard-Plot für die weitere Analyse verglichen.
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Representative Results
- DPSCs, die durch enzymatische Spaltung (DPSC-ED) erhalten wurden, werden hier am Tag 10, 15,18 (Figur 1) dargestellt. Die Kolonien eingeleitet, auf fast 3 bis 5 Tagen nach der Isolierung zu bilden.
- Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) sind in Abbildung 2 an Tag 5, 10, 13 und 18 dargestellt. Fibroblast-ähnliche Zellen aus Pulpagewebe in den Kolben wandern begann parallel Bestellung um fast 5 Tage nach der Aussaat.
- DPSCs bei Passage 3 mit beiden Methoden sind in Abbildung 3 dargestellt. Beide DPSCs waren fast in der gleichen Größe und Morphologie.
- Immunphänotypisierung führt DPSC-ED und DPSC-OG (Abbildung 4). Diese Ergebnisse zeigten die Gegenwart von mesenchymalen Stammzellen des Marker wie CD44, CD73, CD105 und CD90, und die Abwesenheit von hämatopoetischen und endothelialen Marker wie CD34, CD45 und CD11b . Die Ausdrücke der CD105 & CD146 (perivaskuläre Marker) waren in DPSC-OG im Vergleich mit DPSC-ED.STRO-1 war in beiden Gruppen negativ. (Blaue Linien genannten OG Gruppe, während rote Linien genannten ED ein, angegeben gelben Linien Isotypen.)
- Alizarinrot S & Morphologie Quantifizierungsergebnisse zur Auswertung von mineralisierten Gewebebildung in DPSC-ED und DPSC-OG an Tag 21 werden in 5 gezeigt. Je absorbierenden rote Farbe umso Kalziumablagerung. Diese Ergebnisse zeigen weitere Kalziumablagerung in differenzierten DPSC-ED (d) im Vergleich mit DPSC-OG (c). (Triplicate technischen Wiederholungen) Quantifizierung von Alizarin Red S auch darauf hin, die signifikante (*) höhere Konzentration des Farbstoffs zwischen DPSC-ED im Vergleich mit OG-Gruppen. (Dye-Konzentration stieg ebenfalls signifikant (**, ***) zwischen den Tests und Kontrollen von jeder Gruppe (ED oder OG), die die Kalziumablagerung angegeben werden nach der Differenzierung)
(Anmerkungen: A gepaarten t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in der BestimmungMenge des mineralisierten Matrix hergestellt ED und OG Gruppen nach Induktion der Differenzierung. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. (Bedeutung für P ausgegangen <0,05)
- QPCR Ergebnisse der Expression Odontoblast und mineralisierten-verwandten Genen (DSPP) und (MEPE, ALP) jeweils in differenzierten DPSC-ED & DPSC-OG werden in 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten die signifikante Hochregulation von ALP & MEPE nach der Differenzierung von ED und OG Gruppen. Inzwischen waren ALP und MEPE Ausdrücken deutlich höher differenzierten DPSC-ED gegenüber dem differenzierten DPSC-OG. Jedoch gibt es keinen Unterschied bei der Expression in differenzierten Zellen DSPP zwischen beiden Gruppen (Housekeeping-Gen: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein (YWHAZ)). 28
(Hinweis:. Die qPCR-Daten wurden unter Verwendung der vergleichenden CT-Methode A pa ired t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen ED & OG Gruppen vor und nach der Differentiation, und auch zwischen differenzierten Zellen von zwei Gruppen zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. (Bedeutung für die P ausgegangen <0,05) (Triplicate technischen Wiederholungen)
Abbildung 1. Enzymatische dissoziiert DPSC (DPSC-ED) an Tag 10, 15 und 18. Vergrößerung bar = 200 um.
Abbildung 2. Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) am Tag 5, 10, 13 und 18 Jahren. Vergrößerung bar = 200 um.
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Abbildung 3. Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) & enzymatische verdaut DPSCs (DPSC-ED) Morphologien in Durchgang 3. Vergrößerung bar = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Überlagerte Histogramm der Immunphänotypisierung Ergebnisse in DPSC-ED (dunkelrot) und DPSC-OG (Blau). (Yellow Linien repräsentieren Isotypen). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Abbildung 5. Alizarinrot S Färbeergebnisse in differenzierten DPSC-OG (c), und differenzierte DPSC-ED (d). (A) und (b) zu den Kontrollen bezeichnet. Quantifizierung von Alizarin Red S-Assay zeigen mehr Farbstoffabsorption in differenzierten DPSC-ED gegenüber dem differenzierten OG Gruppe (e). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 6. QPCR Ergebnisse der Expression Odontoblast und mineralisierten-verwandten Genen (DSPP) und (MEPE, ALP) jeweils in differenzierten DPSC-ED-OG & DPSC. Die Expression MEPE, ALP, & DSPP in differenzierten Zellen an die Steuereinheit bestätigt, vergleiche die Differenzierung der beiden Gruppen in Odontoblast (ac). Diese rrgebnisse zeigte die signifikante Hochregulation der ALP & MEPE nach der Differenzierung von ED und OG Gruppen (a & b). Unterdessen wurden ALP und MEPE Ausdrücken signifikant höher in differenzierten DPSC-ED gegenüber dem differenzierten DPSC-OG (a & b). Allerdings gibt es keinen Unterschied in der Expression von DSPP in differenzierten Zellen beider Gruppen (c) (Housekeeping-Gen: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-Monooxygenase activation protein; YWHAZ). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung und Charakterisierung von hDPSCs von Zahnpulpa mit zwei Methoden, enzymatische Dissoziation und direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate. Zusätzlich wird in vitro Differenzierung dieser Zellen in Odontoblasten, wurde durch quantitative Alizarinrot S & Assay QPCR beurteilt.
Bestehenden Protokollen zur Isolierung Pulpagewebe aus menschlichen Zahns worden verschiedenen Instrumente wie Zangen (Knochenzange) 9, Exstirpation Nadel 29, Gracey Kürette 30, dentale Bohrer Fissur 4 usw. Diese Methoden sind zeitaufwendig, unter Berücksichtigung geringen verwendeten Überhitzung von Zellstoff durch Zugabe von Wasser kontinuierlich. Jedoch in aktuellen Technik wird dentalen Diamantscheibe zur Isolierung von Zellstoff Gewebe, das eine schnelle Weise zu Zahn mit minimalem Kontamination in einem einstufigen Verfahren geschnitten ist, verwendet, und minimiert die Überhitzung der Pulpe während eines Schneidvorganges. Außerdem hDPSCs aschließlich in Odontoblasten, die noch nie im Fall der menschlichen Zähne durch diskutierten Ziel im Vergleich differenziert wieder. Vergleichende Bewertung der differenzierten hDPSCs (ED & OG Gruppen) durch quantitative Alizarin Red S-Assay zeigte die höhere Mineralisierung Potenzial hDPSC-ED im Vergleich mit OG-Gruppe. Diese Ergebnisse auch durch QPCR bestätigt. DSPP, ALP und MEPE als Mineralisierung Marker hochreguliert nach der Odontoblasten Differenzierung in beiden Gruppen. Auf der anderen Seite waren die Ausdrücke der MEPE & ALP höher in differenzierten hDPSC-ED im Vergleich zur Kontrollgruppe. In Übereinstimmung mit früheren Studie über Milchzähne 27, Stammzellen aus bleibenden Zähne durch ED oder OG Trennung Methoden abgeleitet zeigen auch ähnliche Differenzierung Verhaltensweisen unter den gleichen Bedingungen. Darüber hinaus zur besseren vergleichende Auswertung, die in dieser Studie wurden sowohl hDPSC-ED-OG & hDPSC derselben Individuen isoliert.
Expressions of MSC Marker eind die Abwesenheit heamatopietic / endothelialen Marker identifizieren beide hDPSCs als mesenchymale Stammzellen. Auf der anderen Seite waren CD 105 / CD 146 höher in DPSC-OG Vergleich zu den ED Gruppen. Trotz der vorhandenen Hinweise entsprechend dem Vorhandensein STRO-1 in DPSCs 31 zeigten unsere Ergebnisse keine Expression von STRO-1 in beiden Gruppen. Allerdings könnte die erhebliche Vielfalt in Oberflächenmarker Expression in verschiedenen Studien werden durch die entweder Anbaubedingungen wie Passage-Nummer, Zusammensetzung der Medien, etc. oder interindividuellen Schwankungen zwischen verschiedenen Spendern. Das Fehlen STRO-1 in beiden Gruppen kann angeben, dass die Expression dieses Markers möglicherweise nicht direkt beeinflussen Odontoblast Differenzierungspotenzial (nicht im Video gezeigt).
Verschiedene hDPSCs Trennung Zustand bringen könnte unterschiedlicher Differenzierung Kapazität. Diese Unterschiede könnten darauf zurückzuführen sein, die Existenz von verschiedenen Populationen in der Zellstoff-Gewebe. So wählen die Isolation Methoden might nützlich sein für gezielte Gewebe spezifisch Reparatur und Regeneration für zukünftige klinische Ansätze. Unsere Ergebnisse zeigten die höhere Mineralisierung Kapazität von enzymatischen verdaut DPSC im Vergleich zu den entwachsen diejenigen. Allerdings sind zusätzliche Studien wie die Bewertung der Bildung von röhrenförmigen Struktur in vivo und in vitro, erforderlich, um festzustellen, welche dieser beiden Verfahren ist anwendbar für funktionelle Dentin / Pulpa Geweberegeneration Therapien.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei für ihre kritischen Diskus und Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif für seine technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
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